谷氨酸脱羧酶(GAD)抗体是引起中枢神经系统某些自身免疫疾病的致病性抗体之一。对于该类抗体在不同人群和疾病组中的分布，多国学者均做过调查研究。目前其准确的发病机制仍待进一步阐明。
       今天笔者为大家带来的译文原文节选自西班牙巴塞罗那的奥古斯特·皮伊·苏涅尔生物医学研究所(IDIBAPS)发表的论文，希望能给广大读者带来启发。

文章信息

题目: 

GAD抗体相关神经系统综合征抑制性突触蛋白抗体的种类和分布

Antibodies to Inhibitory Synaptic Proteins in Neurological Syndromes Associated with Glutamic Acid Decarboxylase Autoimmunity

期刊：PLOS ONE

发表时间：2015年3月

作者：Nuria Gresa-Arribas, Helena Ariño, Eugenia Martínez-Hernández, Mar Petit-Pedrol, Lidia Sabater, Albert Saiz, Josep Dalmau, Francesc Graus

摘要

谷氨酸脱羧酶抗体与多种神经系统综合征相关。目前仍不能明确综合征的多样性与不同的免疫显性表位相关，还是与其他抑制性神经突触蛋白的特异性抗体相关。我们对106位GAD抗体相关综合征患者(39例小脑共济失调、32例僵人综合征、18例癫痫、17例边缘叶脑炎)检查了血清与脑脊液。GAD65抗体滴度使用ELISA定量检测。免疫印迹法用于检测GAD65与GAD67抗原表位是否为线性结构。在细胞学检测中使用HEK293表达系统表达N端GAD65、中心催化功能域、以及C端GAD65，用于检测免疫显性域。GAD67、GABAA受体、甘氨酸受体、GABAa受体相关蛋白以及桥蛋白这些物质的特意抗体使用CBA检测。GAD抗体内化使用培养的大鼠海马神经元检测。脑脊液GAD抗体滴度在小脑共济失调患者与边缘叶脑炎患者中要高于僵人综合征患者(p=0.02）。在81%血清样本与100%脑脊液样本中检出GAD67抗体。可被GAD65抗体识别的线性抗原出现于98%的患者中，相比之下GAD67抗体可识别的抗原仅占42%。GAD65催化结构域在93%的患者血清中被识别，22%的血清和74%的脑脊液能同时识别N端，C端以及磷酸吡哆醛(PLP, GAD辅酶)这三个结构域。六例GABAa受体抗体阳性患者和另外六例甘氨酸受体抗体阳性患者未出现相关症状。无患者检出GABAa受体相关蛋白抗体和桥蛋白抗体。GAD65抗体在活的神经元细胞中未发现内化现象。总之，这些研究指出，无论神经系统综合征如何，脑脊液对GAD的免疫应答要普遍于血清，也未发现临床表现与抑制性突触蛋白相关抗体间的特异性关联。

简介

高滴度的谷氨酸脱羧酶抗体可见于多种神经系统综合征患者的血清中，包含僵人综合征、小脑共济失调、癫痫以及边缘叶脑炎。这些病症均表现为神经系统GABA能系统异常。目前尚不清楚部分患者发展为特定综合征的病因。与GAD抗体关联的神经系统综合征初描述于1988年，但到目前为止，未再有更大更全面的研究来比较不同抗GAD相关综合征患者的免疫反应谱和异质性。目前已有的研究规模较小或局限于僵人综合征，重点在GAD65表型，或仅研究患者血清。此外根据推测，在GAD抗体阳性和LE或癫痫患者中，这些症状可能是由针对细胞表面抗原的更相关的自身抗体引起的，并且这些症状对免疫治疗反应良好。从另一个角度，某些边缘叶脑炎患者和单独的GAD抗体阳性患者可能症状更重。因此，确定不同的GAD抗体相关综合征患者是否具有不同的潜在免疫应答可能具有实际的临床意义。

针对GAD65抗体的致病显著性仍存争议。部分研究指出这些抗体是直接的致病因素，但有些证据得出的结论与此相反。首先，相比于其他神经系统表面抗原引起的自身免疫神经系统疾病，GAD抗体阳性神经系统综合征的免疫治疗效果较差；其次，疾病严重程度与抗体滴度间未发现相关性；第三，目前尚无这种神经系统障碍的可信动物模型。阐明致病机制目前仍需重要一步：GAD抗体可与活的神经元结合，在内化后可结合到胞内GAD抗原。

为了验证这些问题，我们检测了106例不同的GAD抗体相关神经系统疾病患者的血清中如下几种结构的抗体：主要免疫优势区，线性抗原和构象抗原，抑制性突触受体或其他蛋白的共存抗体。除此之外观测了GAD抗体是否会被活神经元细胞内化。

研究方法

患者选自1994年12月至2013年4月间，均由作者或相关医师诊治。这些患者的血清或脑脊液在西班牙巴塞罗那奥古斯特·皮伊·苏涅尔生物医学研究所(IDIBAPS）的神经免疫学实验室，或美国费城的宾夕法尼亚大学中完成检测。入组标准为：存在神经系统障碍的患者经脑部免疫组化检测血清GAD65抗体，并由HEK239构建的CBA加以确认。其中，免疫组化步骤用于检测在放射免疫法下GAD抗体滴度大于2000u/ml的患者。低于这个浓度的患者均患有1型糖尿病，多数从未有过神经系统症状。明确或疑似副肿瘤综合征的患者不包含在本研究中。

方法学构建基于大鼠小脑的免疫组化

藉由亲和素-生物素技术，GAD抗体的免疫反应通过PFA固定的冷冻大鼠小脑观察。待测血清稀释500倍，脑脊液使用原浓度。在二抗的选择中，使用四种鼠抗人IgG1-4作为不同的生物素标记二抗，用以研究这种抗体的IgG亚型。

为了研究GAD抗体的鞘内合成，使用免疫组化得到的GAD滴度结果，连同其对应的脑脊液浓度将配对，同时使用脑脊液/血清白蛋白比值来计算GAD抗体的鞘内合成指数。大于1的比值提示特异性IgG的鞘内合成。

GAD65 ELISA

GAD抗体水平使用RSR的ELISA检测。使用方式均参考产品说明书。由于神经系统综合征中GAD抗体浓度较高，血清和脑脊液中抗体的浓度在检测前一般需要滴定来确认稀释度。一般来讲，血清稀释10000倍或脑脊液稀释200倍后开始检测流程。

免疫印迹法

人类GAD65、GAD67、GABARAP重组蛋白通过电泳进行分离，随后转移至PVDF膜上同患者稀释1000倍的血清孵育。先后结合GAD65、GAD67、GABARAP对应的商品抗体和生物素标记的羊抗人或马抗鼠IgG后，使用DAB盐酸盐显色。在部分试验中我们使用ECL印迹系统。商品化GAD65和GAD67抗体的特异性通过CBA予以确认。

基于HEK293细胞的免疫细胞化学染色

为了检测不同突触抗原的对应抗体，HEK293细胞中转染了人类GAD65和GAD67，以及GABAaR和GABARAP的α1和β3亚单位、甘氨酸受体α1亚单位、桥蛋白。转染24小时后HEK293按流程开始活细胞或固定后检测。HEK293和40倍稀释的患者血清或5倍稀释的脑脊液孵育，同时结合相应的商品化抗体，然后与羊抗人IgG Alexa Fluor 488或羊抗鼠IgG孵育。当使用活的HEK293时，使用4%PFA和0.3% triton X-100进行固定操作。完成同患者血清和商品化抗体结合的操作后，使用荧光显微镜照相。

为了验证构建的CBA，使用50例不同神经系统障碍患者(20神经系统退行性变、15例NMDAR抗体阳性、10例Hu抗体阳性、5例其他神经免疫疾病)的血清和17例1型糖尿病患者血清进行性能验证。全部血清在本CBA中均检测为阴性。T1DM组患者中，10例患者抗体滴度较高。这提示本方法相比于放射免疫法，在T1DM典型的抗体滴度区间内对低滴度GAD65抗体缺乏足够的灵敏度。

GAD65表型分析

我们设计了表达N端(aa 1-188）、中心区含磷酸吡哆醛(aa189-464)、C端(aa465-585）GAD65的质粒。转染至HEK293后进行相应的免疫组化实验。每种成分的成功表达使用Myc标签蛋白的对应商品抗体加以确认。

神经元表面抗原抗体的分析

使用大鼠脑组织实施免疫组化和大鼠海马、脑神经元培养细胞进行免疫荧光的方式加以研究。

GAD抗体内化研究

为研究GAD抗体的内化过程，GAD抗体阳性脑脊液稀释25倍后，在37℃下和大鼠海马神经元细胞孵育24小时。清洗后和未标记的抗人IgG抗体37度孵育1小时。清洗后使用4%PFA和0.1%triton X-100固定，再加入Alexa Fluor 488标记的抗人IgG。我们选择了NMDAR抗体阳性的脑脊液作为阳性对照。

统计分析

使用非参数检验、卡方、ANOVA作为检验方法。由于ELISA值不遵从正态分布，在统计分析前使用对数变换将其标准化。P<0.05视为有显著意义。

结果

抗体检测结果

在CBA中，100%患者均检出GAD65抗体、88%患者检出GAD67抗体。GAD67抗体在小脑共济失调、僵人综合征、边缘叶脑炎以及癫痫组中无频数的显著差异。相反，全部脑脊液(61例）均同时检出GAD65和GAD67抗体。在配对样品中有9对样品呈现血清阴性但脑脊液GAD67阳性。这9例样品均匀分布与各患者组中。免疫组化分析IgG亚型显示全部106例患者中占主导地位的亚型为IgG1。

在小脑共济失调组和边缘叶脑炎组中，血清GAD65抗体水平较高。在脑脊液中这个结论也成立，即共济失调组和边缘叶脑炎组的脑脊液浓度高于僵人综合征组。此外，小脑共济失调组的鞘内合成指数的中位数(9.7)也要高于僵人综合征组(5.3),p=0.38. 无论患者血清中是否含有GAD67抗体，血清GAD67抗体含量与GAD65浓度均相关(p=0.02)

GAD抗体表型分析

为阐明GAD65与GAD67抗体是否能辨识线性抗原，全部106例样品使用免疫印迹法进行筛查。除两例外其余98%样品均和GAD65抗原反应。39例（39/93)GAD67阳性患者为免疫印迹阳性。可与GAD67反应的血清，与特定的神经系统综合征间无相关性。

研究GAD65抗体与不同症状组GAD65抗原活性区(N/C/PLP）间的关系。由于亚克隆并未对GAD65免疫活性构成影响，我们使用全部106例血清和脑脊液使用转染这三个部分的HEK239进行检测。46%患者血清GAD65抗体仅识别一个区域，相比之下74%GAD65阳性脑脊液可识别全部三个区域。被识别频数占据主流的部分为磷酸吡哆醛(PLP），有93%患者样品可识别此结构域，这其中也包含部分GAD65抗体浓度较低的患者。GAD65抗体水平和对特定表型的反应间无相关性。边缘叶脑炎患者组的GAD65抗体更倾向于结合N端域，癫痫组患者体内抗体倾向于结合C端域。我们在脑脊液结果中未发现此差异。抗体识别的结构域数量频数在有或无GAD67的两组抗体组中较相似。因此GAD67抗体的存在与GAD65反应程度无相关性。

GABA能抑制性突触的其他抗体

106例血清和61例脑脊液接受了大鼠海马神经元免疫荧光测试。其中6名患者检出GABAaR抗体，6名患者检出甘氨酸受体抗体阳性。除此之外未检出其他抗体。

GAD抗体的内化过程

假定GAD抗体为致病抗体，抗体应能接触到胞内抗原，因此该抗体可形成内化。在这个试验中我们首先确认我们培养的神经元细胞内包含有GAD65。首先我们固定了神经元细胞，然后分别同商品化的GAD65抗体以及患者的脑脊液一同孵育。在这项预试验中我们确认了细胞内含有对应抗原，同时商品抗体和患者脑脊液中均观察到当细胞膜通透时，发生了抗原抗体结合。我们又实验了患者体内的抗体能否同活的神经元细胞反应，使用大鼠海马神经元细胞分别同4例小脑共济失调、4例僵人综合征、3例边缘叶脑炎、5例癫痫患者的含抗体脑脊液孵育24小时。在这个实验中我们选择了一例抗NMDAR脑炎患者的脑脊液作为对照。实验结果中我们未观察到4个实验组以及对照组出现胞内染色。因此我们得出结论，GAD65抗体仅仅在细胞膜高通透状态下与GAD65抗原结合，在活体神经元细胞中无法完成这一过程。

讨论和结论

我们总结了以下特性：

1. 在血清和脑脊液中的体液免疫响应存在差异。脑脊液中的抗体可以与多个结构域结合，同时与GAD67可发生反应。由于9/61例患者出现血清阴性脑脊液阳性的结果，加上脑脊液抗体可识别更别结构域，这提示脑脊液中的GAD65抗体不仅仅是从血清到脑脊液的被动转移，还可能存在中枢神经系统的主动响应。

2. 边缘叶脑炎和小脑共济失调患者的脑脊液抗体滴度比僵人综合征患者高。

3. 全部神经系统综合征患者中GABA能抑制性突触抗原抗体出现的频数非常少

4. GAD抗体因其未观察到内化效应，因此可能不是直接的致病因素。

5. 我们未发现桥蛋白和GABARAP抗体。过往报道中指出仅1例僵人综合征患者伴发纵隔肿瘤时检出这两种抗体，但报道发表于2006年且从未被重现过。同时检测方法学也存在差异：GABARAP抗体初使用免疫共沉淀和免疫印迹法检测，我们在本研究中使用CBA。我们无法证实是否因CBA的灵敏度过低导致这种结果，如果并非如此，GABARAP抗体的水平应非常低。

6. GAD65抗体表型的研究中提示，1型糖尿病中的GAD65抗体大部分识别磷酸吡哆醛部分和C端结构域。先前的僵人综合征队列研究中指出，GAD65抗体识别C端两个不连续的结构域，大部分血清抗体可识别N端至少一个结构域。其他研究者也发现了一个位于N端的线性表型抗原。在我们的研究中磷酸吡哆醛部分是血清抗体识别频数多的，在全部僵人综合征患者中均可被识别，可认为是提供主要免疫原性的部位。在全部4个患者组中我们未发现主要免疫原部位的显著差异。由于本研究中将GAD65分解为3个大片段，可能会遗漏一些较小的蛋白质片段，这些片段抗原有可能会引起特定的神经系统综合征。

7. GAD抗体的病理学作用一直受到争论。体外研究指出僵人综合征患者的GAD抗体抑制了GAD65的酶活性，而1型糖尿病患者的抗体不存在这个现象。来自GAD抗体阳性的僵人综合征患者和小脑共济失调患者纯化的抗体或直接使用人单抗，经鞘内或小脑内注射后可诱发类似这些患者的症状或神经生理学改变。然而这些实验未能明确阐述这些变化与GAD65抗体直接相关。于此相似的是对动物的主动免疫实验并未引起神经系统障碍。想证明GAD65的直接致病性需要先证实GAD65抗体在活体内存在内化反应。先前研究中指出GAD65人单抗可被大鼠中枢神经系统细胞系内化，或被大鼠脑皮层注射部位附近的神经元内化。然而这些研究无一例证实体内也存在相同反应。为了进一步探究GAD65的致病性，我们需在将来的研究中明确的阐述动物模型中GAD抗体如何到达抗原处，通过高分共聚焦显微镜观察抗原抗体的结合，观察与综合征相关联的GAD的潜在影响。

因此，本研究重申了研究中枢神经系统综合征患者脑脊液中GAD自身免疫的重要性，因其抗体在中枢神经系统中可识别抗原上多种免疫原结构域。我们未发现GAD抗体相关综合征中特定的免疫优势区或相关抗体可作为标志物。更多的是，GAD抗体因其在活细胞中无法内化，其直接致病性仍存疑。