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经典回顾|基于M22的TRAb检测方法
更新时间:2023-08-14   点击次数:519次



来自RSR FIRS 实验室的 Sanders等发现[5],小鼠促甲状腺激素单克隆抗体与促甲状腺激素受体(TSHR)的结合,可以被促甲状腺激素受体自身抗体(TRAb)所抑制。实验室用放射性125I标记的人TSHR单克隆抗体(M22™)构建了一种分析方法[6]。


本文我们描述了一种检测TRAb的新方法,其中TRAb竞争抑制了促甲状腺激素受体人单克隆抗体M22(生物素标记)与包被于酶联免疫法(ELISA)微孔板上的TSHR的结合。同时我们将基于M22与基于TSH结合抑制的方法进行了比较。





研究对象与方法




检测方法

三代TRAb(RSR促甲状腺激素受体抗体检测试剂盒):基于M22与血清中TRAb竞争抑制的ELISA法。TRAb每次检测均包括一套使用正常混合血清(HBD pool)稀释后的TSHR自身抗体国际标准物质NIBSC90/672。结果以每升M22-生物素结合的百分比抑制率为单位(1-[检测血清的OD450/HBD的OD450])×100。


二代TRAb(RSR促甲状腺激素受体抗体检测试剂盒):基于TSH与血清中TRAb竞争抑制的ELISA法。


放免法:Southgate等人[7]所述,利用TRAb与125I标记的TSH间竞争结合可溶性猪TSHR的机制测定血清中TRAb含量(RSR试剂盒)。


甲状腺过氧化物酶(TPOAb)和甲状腺球蛋白(TgAb)的自身抗体采用Beever等人[8]的直接测定法测定。TPOAb单位U/mL(NIBSC 66/387),测量范围为1.5 - 500 U/mL;TgAb单位U/mL(NIBSC 65/093),测量范围为3 - 1000 U/mL。


结果


标准物质90/672在三种不同的TSHR自身抗体检测法中的剂量-效应关系见图1。

图1 90/672对促甲状腺激素受体(TSHR)与抗体结合抑制的影响。


标准物质90/672 浓度为0.2 U/L时,对M22-生物素结合的抑制率约为10%;浓度为0.8 U/L时,对TSH-生物素结合的抑制率约为10%。在基于PEG的实验中,125I标记的TSH结合抑制率约为10%时,标准物质浓度约为2 U/L。


在相同结合抑制率(10%)的前提下,标准物质浓度由小到大依次为:M22-biotin,TSH-biotin,125I-TSH(PEG)。


三代TRAb的批内检测精密度:


对一份正常混合血清进行64次测量得到的平均值±标准差(SD)为0.041±0.04 U/L (450 nm处的平均吸光度=2.1±0.079),表明该检测法的检测下限(2倍SD)为0.12 U/L。


三代TRAb的批间精密度如下(图2):在0.3 U/L时为14%,在6 U/L时为6.5%。


二代TRAb的批间CV值,在1 U/L时为20%,在4 U/L时为6%。


图2 不同患者血清间变异系数(CV)与TRAb浓度的关系图。


三代TRAb测定M22结合的抑制率如下:

图3 基于M22-生物素对TSHR结合的抑制,使用ELISA检测不同患者组的自身抗体。MG,重症肌无力;SLE,全身性红斑狼疮;RA,类风湿性关节炎;HBD,健康献血者。



在108例Graves组中三代TRAb与二代TRAb之间结合抑制率的相关系数r值为0.99,如图4所示。


图4 比较M22-生物素对TSHR包被的ELISA板孔和TSH-生物素对TSHR包被的ELISA板孔的抑制作用,来自108名Graves病患者(治疗和未治疗)。如图所示的线与每个轴呈45度角。通过图上的点进行最佳拟合的直线(未显示)的方程是y=1.084x-10.56,r=0.99。


三代TRAb、二代TRAb和125I-TSH(放免法)检测TRAb的受试者工作曲线(ROC)[9]见图5。在此分析中,灵敏度数据来自108例Graves病组。特异性数据来自60例无临床甲状腺疾病证据的患者(和临床工作人员)组。当特异性为100%时,三代TRAb、二代TRAb和放免法的灵敏度分别为95%、89%和62%。

图5 三种不同TSHR自身抗体检测的灵敏度与100-特异性的关系图。


干扰性研究中,TSH (NIBSC 94/674)最高达3 U/L,人绒毛膜促性腺激素(hCG) (NIBSC 75/589)最高达160 U/mL,促卵泡激素FSH (NIBSC 92/640)最高达69 U/mL,促黄体生成素LH (NIBSC 80/552)最高达10 U/mL,对M22-生物素与TSHR的结合没有影响(结合的最大抑制率为0%)。


讨论

我们的结果表明,三代TRAb与二代TRAb及其类似方法相比,可以检测出更低浓度的TRAb标准物质(NIBSC 90/672)。 三代TRAb的精密度优于二代TRAb产品。


在108例Graves病组,几乎所有的样本用三代TRAb比二代TRAb有更好的竞争抑制效果。以二代检测抑制率为20%为对照,只有1份血清样本在基于M22检测的三代检测中具有明显较弱的效果(14%抑制率)(图4;结果经多次重复测定证实)。


在307例对照组(包括临床工作人员、健康献血者和未诊断为Graves病的患者)中,只有2例(0.65%)对M22结合的抑制率大于10%。其中一例患者(三代TRAb抑制率11%)报告过度疲劳(无明确原因),另一例患者(三代TRAb抑制率12%)有原发性甲状旁腺功能减退和自身免疫性甲状腺功能减退。目前尚不清楚这些低检测值(在反复试验中得到证实)是试验中非特异性干扰的结果,还是与低水平TRAb有关。但在二代TRAb和放免法中,两例患者的血清均为TRAb阴性,但两例患者的血清均含有TPO自身抗体(按先后顺序分别为20 U/mL和70 U/mL)。


在特异性方面,三代TRAb不受TPO自身抗体或Tg自身抗体的影响,在18例自身免疫性甲状腺功能减退患者中的17例未观察到抑制现象,17例患者中一些患者一种或两种自身抗体水平较高(9/17例TPOAb水平大于500 U/mL,4/17例TgAb水平大于1000 U/mL)。同样,乙酰胆碱受体、dsDNA和类风湿因子的自身抗体均不抑制M22的结合(图3),进一步强调了该试验的特异性。此外,高浓度的TSH(最高达3 U/L)、FSH(最高达69 U/mL)、LH(最高达10 U/mL)或hCG(最高达160 U/mL)对检测没有任何干扰。


图5所示的ROC图显示,在108例Graves病组中,有5例(4.6%)TRAb检测为阴性。在这5例患者中,患者A因甲状腺相关眼病接受甲状腺素(T4) (有131I治疗史)和糖皮质激素治疗;患者B予卡比马唑+T4治疗5年;患者C卡比马唑停药9年,采血前甲状腺功能正常;D患者接受T4治疗(1976年用131I治疗)。患者E在进行TRAb检测时没有临床资料。二代TRAb测定A-E患者血清中TRAb均为阴性(均小于1 U/L,抑制率小于10%),放免法结果呈阴性或在灰区(TSH结合的抑制率为6% - 15%)。此外,5份血清中均未检测到Tg自身抗体,1份血清中TPO自身抗体水平较低(2.5 U/mL)。我们无法在这5份血清中检测到TRAb,这可能与5例患者中至少4例在临床和生化特征,以及对TSHR缺乏主动免疫反应的原因有关。


二代TRAb能检测到96/108(89%)的Graves病血清,特异性为100%。二代ELISA结果阳性的样本,在三代ELISA中均能检测到。ROC曲线同时强调,相比于放免法,固相包被TSHR的ELISA方法更有优越性。在放免法中,100%的特异性情况下,108份Graves血清中只有67份(62%)被检测到TRAb,其灵敏度明显低于本文介绍的新TRAb测定方法。


基于标记的TSHR单克隆抗体检测TSHR自身抗体的方法已有报道[5,6]。然而,基于纯化Graves患者IgG检测TSHR自身抗体的方法早在几十年前就有报道[10,11]。然而,在TSHR自身抗体检测中,与亲和纯化的患者血清自身抗体作为配体相比,人或动物TSHR单克隆抗体确实具有相当大的优势,例如这类单抗容易生产为大批量、质地均匀、纯净且稳定的制剂。单克隆抗体也相对容易操作(例如,通过片段化或突变),以获得适合特定测定系统的制剂。


三代TRAb与二代TRAb间检测Graves病血清TRAb结果密切相关(r=0.99)。此外,来自FIRS 实验室的Sanders等人也观察到一系列Graves病患者血清在抑制小鼠促甲状腺激素受体单克隆抗体对TSHR的结合抑制,以及患者血清对标记TSH和TSHR之间的结合抑制间的密切关系[5]。此外,无论自身抗体是常见的刺激型还是少见的阻断型,对受体的结合效果似乎效果接近[5,6,13]。这些早期的研究和目前的报道都强调了患者血清中TSHR自身抗体(无论刺激型或阻断型)、TSH和促甲状腺单克隆抗体(包括M22™)在TSHR上的结合位点之间的密切关系。然而,研究结果与有关TSHR不同区域参与TSHR自身抗体与TSH激动剂和TSH拮抗剂特性结合的报道不一致[14-16]。


总之,我们所描述的基于M22-生物素的TRAb的最新第三代检测方法比起早期检测方法有相当大的优势,在检测低水平自身抗体方面是非常可靠的。尤其需要评估低水平TSHR自身抗体检测,三代TRAb在早期轻度Graves病患者和有Graves病眼部体征但无甲亢史的患者中具有应用价值。


参考文献 Smith B R ,  Bolton J ,  Young S , et al. A New Assay for Thyrotropin Receptor Autoantibodies[J]. Thyroid, 2004, 14(10):830-835.





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