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重症肌无力抗体的测定步骤如下
发布时间:2022-01-21   点击次数:111次
  重症肌无力(myastheniagravis,MG)是一种T细胞依赖的乙酰胆碱受体抗体(AChR-Ab)介导的自身免疫性神经肌肉接头处的疾病。MG的基本病理机制是AChR-Ab介导的神经肌接头终板突触后膜上乙酰胆碱受体(AChR)数量的减少。乙酰胆碱受体抗体是MG主要的自身抗体,由自身反应性T淋巴细胞激活体内的B淋巴细胞产生。FcyRIIB是细胞表面免疫球蛋白IgG的Fc段受体之一,是一个能与IgG的Fc段低亲和力结合的抑制性受体,也是表达于B淋巴细胞表面的免疫球蛋白受体,在调节免疫反应中具有重要作用。
  重症肌无力抗体的测定步骤如下:
  1.抗原包被:用PH值9.6的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液将纯化的AChR以0.5ug/ml的浓度进行稀释,按每孔0.1ml小心加入酶标板各孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出,不可产生气泡。然后用封板膜封好反应孔,放在4℃冰箱中12小时过夜。
  2.洗涤:倒尽板孔中液体,吸干孔内残余反应液,空干,加满洗涤液晃动2min,倒去,反复4次,将反应板倒置在吸水纸上,拍干。
  3.封闭:在各反应孔中加满含2%牛血清蛋白的PH值7.4/0.01M的PBS,室温下孵育30min。
  4.加血清:按上述方法再洗涤4次后,在各反应孔中加入用0.01M,PH值为7.4的PBS-Tween20稀释100倍的MG患者的血清0.1ml,每份标本做两孔检测,留2孔为空白对照。用封板膜封好各反应孔,37℃水浴90min。
  5.加HRP-羊抗人IgG抗体:按上述方法洗涤4次后,在各反应孔中加入用0.01M,PH值为7.4的PBS-Tween20稀释1000倍的HRP-羊抗人IgG抗体0.1ml,用封板膜封好各反应孔,37℃水浴90min。
  6.加底物:按上述方法洗涤4次,在各反应孔中加入显色剂A液和显色剂B液各70ul,用封板膜封好各反应孔。避光显色10min。
  7.加终止液:在各反应孔中加入终止液50ul,终止显色反应。
  8.结果判读:根据有无显色反应判定结果的阴、阳性。
  9.终止显色反应30min内在酶标仪上读取450mm/630mm的OD值。将MG患者的OD值减去空白对照的OD值即为结果,每份血清的结果为两孔平均值。该结果与血清中抗AChR-lgG水平为半对数关系,OD值越高则血清中抗AChR-IgG的水平越高。
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