谷氨酸脱羧酶自身抗体ELISA试剂盒的测定步骤须知

更新时间：2026-01-13

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　　谷氨酸脱羧酶自身抗体ELISA试剂盒是一种用于检测人或其他动物血清、血浆等样本中谷氨酸脱羧酶自身抗体的免疫学检测工具。

　　1.固相载体包被：将纯化的谷氨酸脱羧酶抗原或特异性捕获抗体预先吸附在微孔板表面，形成固相载体。这一步骤确保后续反应在固定界面进行，简化操作流程。

　　2.样本孵育与结合：加入待测样本后，若其中含有GAD-Ab，则会与固相载体上的抗原/抗体发生特异性结合。通过37℃温育优化反应条件，促进抗原-抗体复合物的形成。

　　3.洗涤去除干扰：采用缓冲液多次洗涤，清除未结合成分及非特异性吸附物质，降低背景干扰。此步骤对提高检测准确性至关重要。

　　4.酶标二抗反应：加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体，使其与已结合的GAD-Ab进一步结合，形成“夹心结构”。酶标抗体可放大信号，增强检测灵敏度。

　　5.底物显色与定量：TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成的黄色。颜色的深浅和样品中的(GAD)elisa检测呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。

　　谷氨酸脱羧酶自身抗体ELISA试剂盒的测定步骤：

　　-采集与处理：使用无抗凝剂或EDTA抗凝管采集静脉血，离心分离血清/血浆(3000rpm，10-15分钟)。

　　-稀释：根据试剂盒说明书要求，用样本稀释液将血清/血浆按比例稀释(如1:100)。

　　-避免反复冻融：样本分装保存，长期储存于-20℃或-80℃。

　　-平衡温度：实验前将所有试剂(包括标准品、对照品、洗涤液等)平衡至室温(20-25℃)。

　　-配制工作液：

　　-浓缩洗涤液：按说明书比例用蒸馏水稀释(如1:20)。

　　-酶标 conjugate：用相应稀释液配制(如1:100)。

　　-包被微孔板：已预包被GAD65抗原的微孔板无需额外处理。

　　-加样顺序：

　　1.空白孔：加入样本稀释液(作为零对照)。

　　2.标准品孔：梯度浓度标准品(如0、5、10、25、50、100 U/mL)。

　　3.质控孔：高、低值质控品。

　　4.样本孔：加入稀释后的待测样本(每孔100μL)。

　　-孵育：37℃温育30-60分钟(具体时间依试剂盒而定)。

　　-用洗板机或手动洗涤：每孔注入300-500μL洗涤液，浸泡10-15秒，重复3-5次，拍干残留液体。

　　-每孔加入100μL酶标二抗(如HRP标记的抗人IgG)，37℃孵育30分钟。

　　-加入底物液(如TMB)100μL/孔，避光显色15-30分钟(颜色由蓝变黄)。

　　-加入终止液(如2M HSO)50μL/孔，立即测定吸光度(OD值，波长450nm)。

　　-绘制标准曲线(四参数Logistic回归)，根据样本OD值计算浓度。

　　-阳性判定：通常以≥临界值(如10 U/mL)为阳性。