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桥式ELISA法检测成人糖尿病患者血清中ZnT8抗体
发布时间:2018-05-24   点击次数:736次

锌转运体8是β细胞特有的跨膜蛋白,其位于胰岛素分泌颗粒中,参考膜内外锌离子浓度的调节。因此锌转运体8也成为了1型糖尿病重要的自身抗原。

一、前言

锌转运体8自身抗体主要同锌转运体8 C端结构域结合,人群基因的多态性使第325氨基酸的密码子可表达出三种蛋白质:精氨酸(R)325,色氨酸(W)325,少数情况下表达为谷氨酰胺(Q)325。锌转运体8自身抗体可以特异性识别R325、W325类,或识别非特异性残基325,极少数情况下可与Q型结合。RSR公司锌转运体8自身抗体检测试剂盒可定量检测R325、W325以及非特异性残基325型自身抗体。检测锌转运体8抗体可与检测谷氨酸脱羧酶抗体、胰岛细胞抗原2抗体等项目形成互补。相比于检测单种抗体,同时检测多项抗体阳性更具诊断价值。

二、料与方法

1.材料

血清样本,来源:

1)94例1型糖尿病患者(T1DM);

2)51例成人隐匿型自免糖尿病患者(LADY);

3)59例2型糖尿病患者(T2DM)包括28例初诊断及31例不同治疗过程患者;

4)200名健康志愿者(HBD);

5)30例格雷夫斯氏病患者;

6)20例阿狄森氏病患者。

2.方法

1)桥式ELISA法(RSR Ltd)

2)免疫沉淀分析法(immunoprecipitation assay,IPA):35S标记ZnT8抗原,抗原类型分W325/R325二聚体,W325,R325,P325单体。

3)GADAb ELISA试剂盒、IA-2Ab ELISA试剂盒、IAA放免试剂盒,试剂盒来自RSR Ltd。

三、研究结果

1. 精密度分析

用两个质控样品(抗体浓度为50 ± 15 u/mL 和 210 ±50 u/mL)进行批间(n=6)和批内精密度(n=10)分析,中浓度ZnT8Ab批间和批内精密度分别为7.1%和1.7%,高浓度ZnT8Ab批间和批内精密度分别为8.5%和2.7%。

2. ZnT8抗体阳性检测率

用ELISA方法,ZnT8Ab阳性检出率分别为:T1DM 54.3%,LADA 31.4%,T2DM 1.7%。ZnT8Ab ELISA试剂盒检测TIDM及健康人血清样本,通过ROC分析,灵敏性为54%,特异性99%(cut-off 15U/ml),AUC为0.8(95%置信区间,0.74-0.86)。

3. 比较ELISA与IPA方法检测ZnT8

抗体

T1DM患者中,ELISA为54.3%(51/94),IPA为50%(47/94);LADA患者中,ELISA为31.4%(16/51),IPA为29.4%(15/51); T2DM患者中,ELISA为1.7%(1/59),IPA为3.4%(2/59);健康对照(HBD)中,特异性分别为ELISA 99%,IPA为96.5%。

4. 线性分析

线性分析中,阳性质控及血清样本用阴性对照品进行了1:2, 1:5, 1:10, 1:20的稀释。所有样品,ELISA检测结果与IPA(W325/R325二聚体)检测结果具有很好的一致性(r=0.856, k=0.889, n=204)。在1型糖尿病患者和LADA患者中的一致性(r=0.837, k=0.875, n=145)(图4)。


5. 用多种不同的抗体检测试剂盒进行分析

T1DM患者中,对多种抗体检测,阳性率分别为:ZnT8Ab 51/94(54.3%),GAD Ab 70/94(74.5%),IA-2 Ab 42/94(44.7%),IAA 24/94(25.5%)。至少一种方法检测出阳性概率统计为85.1%,仅ZnT8 Ab检测阳性概率为4.3%,ZnT8Ab使阳性检出率从80.9%上升至85.1%;

LADA患者中,GAD Ab全阳性,ZnT8 Ab 16/51(31.4%),IA-2 Ab 12/51(23.5%), IAA 6/51(11.8%);

28例新诊断T2DM患者中,GAD Ab检测只有1例阳性。在所有T2DM患者中(28例新诊断,31例不同时期),检出阳性患者数分别为ZnT8 Ab 1/59(1.7%),GAD Ab 10/59(16.9%), IA-2 Ab 2/59(3.4%),IAA 2/59(3.4%),至少一种抗体阳性统计结果为13/59(22%),没有ZnT8Ab单独呈阳性检出者。

30例格雷夫斯氏病患者ZnT8 Ab ELISA检测无阳性,20例阿狄森氏病患者中ZnT8Ab ELISA检测2例阳性(23.6 和48.2 U/mL),对阳性(23.6 U/ mL)血清用GADAb及IAA检测也成阳性,IA-2Ab呈阴性。另一例ZnT8 Ab ELISA检测阳性(48.2 U/mL)因血清不足未能检测。

四、结论

桥式ELISA是一种简单且可重复的检测血清ZnT8Ab的方法,可提高成人1型糖尿病的抗体阳性检出率。
 

参考文献:Dunseath G, Ananieva-Jordanova R, Coles R, et al. Bridging-type enzyme-linked immunoassay for zinc transporter 8 autoantibody measurements in adult patients with diabetes mellitus[J]. Clinica Chimica Acta, 2015, 447: 90-95.

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