标题： 在自动化系统上(SkyLAB 752) 用ELISA 方法检测乙酰胆碱受体抗体：根据临床和实验室标准协会 (CLSI) EP15-A 评估其分析性能  

作者：Letizia Abbracciavento1, Ruggiero Fumarulo1, Marilina Tampoia1  

摘要：

背景： 乙酰胆碱受体抗体 (AChRAb) 目前在临床实验室中主要通过放射免疫测定法来检测，该法利用从人体肌肉中提取的受体并通过¹²⁵I-α-金环蛇毒素标记进行检测和定量。Hewer 等人（2006）基于纯化的胎儿和成人乙酰胆碱受体的用途，开发了一种新的酶联免疫吸附测定法 (ELISA)。根据临床和实验室标准协会 (CLSI) 的建议，本研究的目的为验证 ELISA 测试并制定其在自动仪器上的实施方案。  

方法： 为了得到批内，不同检测日间和实验室内的精密度，我们使用RSR Ltd厂家诊断试剂盒中的两种 AChRAb 对照品，一种高值阳性对照品 (C1) 和一种低值阳性对照品 (C2)，在不同日内进行了5次独立的试验，每次均进行3次重复检测。诊断试剂盒中包含四种不同浓度的标准品（E1，0.5 nmol/L；E2，1.0 nmol/L；E3，6.5 nmol/L；E4，20 nmol/L），为验证正确度，进行连续五天重复测试。

结果：在精密度测试过程中，高值对照品的检测平均浓度为 11.2 nmol/L（对照 C1），其批内CV值为7.9%（95% CI，0.61~1.52），不同检测日间CV值为 8.4%（95% CI，0.00~2.98），实验室内CV值为11.5%（95%CI，0.92~3.12）。低值对照品的检测平均浓度为3.2 nmol/L（对照 C2），批内CV值为5.6%（95% CI，0.13~0.32），不同检测日间CV值为1.9%（95% CI，0.00~0.33）， 实验室内CV值为6.0% （95% CI，0.15 ~ 0.39）。以标准偏差 (SD) 表示（实验室内）的总重复性，C1 为 1.27，C2 为 0.19，更优于厂家声明的重复性获得的验证值（分别为 1.37 和 0.49）[ SD (C1) = 0.95874 和 SD (C2) = 0.3589]。

结论： 在真实世界中获得的分析性能证实了在实验阶段产生的产品规范参数，并表明即使使用自动化系统进行分析，测试的可靠性仍然保证。测试的良好精密度和准确度及其在易用性和快速响应的自动化系统上的可用性使我们得出结论，该测试对于常规使用是令人满意的，并且可适用于 AChRAb 的长期监测。  

关键词：乙酰胆碱受体抗体，酶联免疫吸附试验，临床和实验室标准协会，验证  

正文：

简介: 重症肌无力(MG)是一种以神经肌肉传递障碍为特征的自身免疫性疾病，乙酰胆碱受体自身抗体(AChRAb) 的检测是诊断重症肌无力 (MG) 一种非常有效且广受认可的方法。

AChRAb可以与成人和胎儿AChR的不同亚基发生反应；然而，大多数 (50%)是与α亚基胞外区特定的免疫显性区域结合[1]。

目前，这些自身抗体的常规检测主要基于用¹²⁵I-α-BuTx 标记的人类 AChR，¹²⁵I-α-BuTx是一种与AChR亲和度高的蛇毒素。

尽管放射免疫法检测AChRAb被广泛应用，但使用放射性化合物有技术和环境上的限制。因此，使用不同技术和不同的抗原制备的检测法作为放射免疫法的替代方法被提出。  

2006年，Hewer 等在使用纯化的胎儿和成人AChR的基础上开发了一种新的酶联免疫吸附测定法 (ELISA) [2]。

这种 ELISA 方法显示出良好的灵敏度(92%) 和出色的特异性(99%)。此外，比较ELISA法和RIA法，显示两种检测法之间有很好的一致性（r = 0.85，n = 83，P<0.001）

为了确保满足建立专业认可的自身免疫实验室所需的要求，我们根据临床和实验室标准协会 (CLSI) 的建议，验证了 ELISA 测试并制定了在自动仪器上的实施方案 [3]。

此外，一旦实施并成为用户的例行程序后，该方法可以通过经认可的外部质量评估计划(UK NEQAS)的参与进行监控。  

材料与方法  

AChRAb ELISA 

Anti-AChRAb ELISA（RSR Ltd，Cardiff，UK）基于竞争抑制法。

自动 ELISA 操作系统  

根据厂家的建议，我们实验室使用Sky-LAB 752自动ELISA操作系统（DASITGroup，Cornaredo，Italy）进行AChRAb 测试。

方法验证  

精密度和真值是验证测试所需的性能参数，根据 CLSI 指南 EP15-A [3] 中的描述进行评估。为了得到批内，不同检测日间和实验室内的精密度，我们使用RSR Ltd厂商试剂盒中的两种商业 AChRAb 对照品，一种高值阳性 (C1, 7.5 nmol/L) 和一种低值阳性 (C2, 1.6 nmol/L)，在不同日内进行了5次独立的试验，每次均进行3次重复检测。为研究正确度，对诊断试剂盒中包含的四种不同浓度水平的标准品（E1，0.5 nmol/L；E2，1.0 nmol/L；E3，6.5 nmol/L；E4，20 nmol/L）进行连续五天复孔检测。

外部质量评估

一旦实施并且该方法成为用户的常规方法，我们于2016年4月至2017年10月参与了英国 NEQAS 质量控制以评估AChRAb的检测。

统计分析

ANOVA测试用于计算批内变异系数 (CV)% 和实验室内 CV%。 使用Analyze it软件版本4.21进行统计分析。

结果  

精密度分析

表 1 和表 2 显示了 5 天内获得的测定值、平均值、标准偏差 (SD) 和方差。

精密度实验中两个阳性对照样品（C1 和 C2）的结果见表 3。

总重复性以 SD（实验室内）表示，结果 C1 为 1.27，C2 为 0.19，低于根据制造商声明的重复性验证值（分别为 1.37 和 0.49），以SD表达 [C1 的 SD = 0.95874 和 C2 的 SD = 0.3589]。

表1  AChRAb 高浓度阳性对照品 (C1, 7.5 nmol/L)5天的检测值、平均值、标准差（SD）和方差  表2  AChRAb 低浓度阳性对照品 (C2, 1.6 nmol/L)5天的检测值、平均值、标准差（SD）和方差   表3  根据 CLSI EP 15-A 使用厂商提供的 2 个阳性对照品（C1 和 C2）进行的精密度实验 表4 根据标准 CLSI EP15-A 使用厂商提供的4个标准品进行正确度实验

正确度研究

使用四种标准品检测分析正确度显示测定值的平均值与真实值之间具有良好的相关性。差异（系统误差）是可以接受的，正如 P 值所证明的那样，这些 P 值无统计学差异（表 4 和图 1）。

图 1 分析方法的不精确估计（系统误差）

AChRAb 的室间质量评价 

对 UK NEQAS 报告提供的数据分析表明，我们的结果在定性数据（阳性/阴性）方面与所有其他 110 个参与实验室（Cohen's k = 1.000）一致。关于定量数据，我们的结果与使用我们 ELISA 方法的实验室的平均值没有显示出统计学差异（Mann-Whitney 检验 p = 0.06）。然而，我们注意到 ELISA 结果在统计学上高于使用 RIA 方法获得的结果（Mann-Whitney 检验 p = 0.0004）。

讨论

AChRAb的测定是MG诊断和临床随访的基本实验室支持[4, 5]。即使AChRAb 滴度不总是与疾病的严重程度相关，但单个患者的连续测定结果可能显示出与MG症状的很好相关性 [6]。

尽管过去推荐的AChRAb 诊断方法是 RIA法，但ELISA方法已经被认为是一种合适的技术 [7]。事实上，英国 NEQAS 报告提供的数据显示，大约一半的参与实验室使用市售的ELISA方法。将ELISA法测定结果与常规 RIA 方法进行比较，来评估其分析性能，发现 RIA 和 ELISA 之间具有很好的一致性 [2]。

根据自身免疫实验室应遵守的技术要求[8]，我们验证并证实了市售AChRAb ELISA在自动化测试时的分析准确性。

使用 SKYLab 752 仪器，我们发现以批内精密度、不同检测日间精密度和实验室内精密度表示的分析误差介于 1.9% 至 11.5% 之间，与其他自身抗体测定相比，该水平的误差*可接受 [9]。在低水平和高水平AChRAb 阳性对照品上测得的总体重复性，更优于制造商声明的性能指标[3]。

因此，在真实世界中获得的分析性能确认了在实验阶段中形成的产品规格参数，并表明即使在自动化系统中进行分析时，测试的可靠性仍然保证。

总体而言，该测试的良好精密度和准确度及其在易用性和快速响应性的自动化系统上的可用性，使我们得出结论：该测试对于常规使用上是令人满意的，并且可能适用于长期监测AChRAb。

为了确保自身免疫实验室质量体系的要求，我们参加了一次有组织的实验室间比较，我们的结果与参与室间质量评价的其他实验室的结果非常吻合 [8]。

因此，我们获得的定性结果与使用相同 ELISA 方法测定AChRAb 的其他实验室提供的平均数据一致。相反，使用RIA方法的实验室提供的定量数据低于ELISA方法提供的数据。

这种差异的可能解释可以用标准品的ELISA 曲线动态范围来表示。抗体浓度测定中的这种差异阻碍了用两种方法获得的结果之间的定量比较。

在建立自身抗体检测的参考标准上，几项行动已实施。例如疾病预防控制中心（CDC）近期批准了一种用于抗环瓜氨酸肽抗体检测的参考物质[10]。乙酰胆碱受体抗体同样需要参考物质，为了能够以国际单位IU对乙酰胆碱受体抗体的检测数据实现定量表示，并协调和标准化这种自身抗体的测定。

｜原文来自｜

作者：Abbracciavento L ,  Fumarulo R ,  Tampoia M .

题目：Anti-AChR antibodies detected by ELISA method using an automated system (SkyLAB 752): evaluation of the analytical performance according to the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) EP15-A[J].

期刊：Italian Journal of Laboratory Medicine

发表时间：2018.1.3

作者单位：Autoimmunology Section, Universitary Clinical Pathology Unit, Polyclinic of Bari, Department of Biomedical Sciences and Human Oncology, University of Bari Medical School, Bari, Italy

译：RSRTJ