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放射免疫沉淀法检测N型电压门控钙通道抗体(N-VGCC)的性能评价
发布时间:2021-10-14   点击次数:142次

摘要


N型电压门控钙通道(N-VGCC)抗体是Lambert-Eaton肌无力综合征(LEMS)患者中第二常见的抗体;33-73%的副肿瘤性LEMS患者中可检测到该抗体。N-VGCC自身抗体还可在各种炎症性神经自身免疫性相关疾病中检测到,包括边缘性脑炎、神经退行性变、精神病学、癫痫和运动障碍。检测N-VGCC抗体与LEMS和其他自身免疫性神经疾病有关,可以为神经系统症状的治疗提供信息,并及时发现潜在肿瘤,提供诊断和预后价值。因此标志物的检测方法需要具备易用性。在这项研究中,我们评估了一种采用RSR N-VGCC Ab试剂盒的放射免疫分析法(RIA)在检测几种自身免疫性神经系统疾病患者中发现的N型电压门控钙通道(N-VGCC)抗体的性能特点。这项评估解决了这一迫在眉睫的临床需求,未来的改进方向旨在优化N-VGCC抗体测试的性能,以便优化患者特征和临床相关性的分类。


 用阳性预测值(PPV)作为分级方法将RIA法(ARUP实验室)与参比的梅奥诊所实验室(MCL)检测方法进行比较。评估的其他性能特征包括特异性、精确性、干扰性和稳定性。实验室间相关性分析提示不同检测方法之间的等价性,但弱阳性结果之间存在一些差异。为了将患者进行最佳分类,需要致力于评估特定抗体相关的临床谱,并在优化检测性能这一事项上达成共识。使用只包含相关抗体的较窄的特定疾病检测谱可抑制假阳性结果,并避免使用宽泛的自身抗体检测谱引起的非预期诊断。

材料与方法

患者


对445份血清进行了评估。其中包括156份血清(50份N-VGCC抗体阳性,106份阴性),此前在梅奥诊所实验室(MCL)检测了N型VGCC和其他与副肿瘤或自身免疫性脑炎相关的神经自身抗体。另有289份血清作为对照(n=187例奥雅纳实验室(ARUP)疾病对照组,即与LEMS或其他自身免疫性神经系统疾病相关的其他抗体呈血清阳性,以及n=102例“自我报告"的健康个体)。对照组包括44例P/Q-VGCC,15例VGKC(6例LGI1阳性,4例CASPR2阳性,5例两者均阴性),15例结合型AChR,5例神经节AChR,3例NMDA,3例GAD65,2例AMPA,2例水通道蛋白4(AQP4)和10例抗核抗体(ANA)阳性,37例P/Q-VGCC抗体疑似,51例P/Q-VGCC抗体阴性。


通过犹他州大学医疗机构接受治疗的N-VGCC阳性患者(n=19)的临床特征是:存在神经系统症状、存在自身免疫性、存在其他免疫状况、恶性肿瘤史、采血年龄和性别。



抗体实验


血清的检测使用实验室开发的RIA法(RSR Limited试剂)。N-VGCC抗体检测的浓度参考区间为阴性、疑似或阳性(<70.0 l="疑似,">110.0 pmol/L=阳性);P/Q-VGCC抗体检测的浓度参考区间为阴性、疑似或阳性(<24.6 l="疑似,">45.6 pmol/L=阳性)。


结果

01

放射免疫法检测N-VGCC抗体的性能特点


N-VGCC RIA的性能与之前在MCL基于分级阳性预测值(PPV)检测的139份血清的结果进行了比较。


 阴阳一致性:用如上所述建立的参考区间(<70.0 l="疑似,">110.0 pmol/L=阳性)将ARUP获得的N-VGCC抗体结果与梅奥临床实验室(MCL)的结果进行比较,总体上一致性较好(图1)。然而,在低滴度阳性样本中观察到部分差异。弱阳性的N-VGCC抗体结果的PPV表明,即使对于参比实验也很难确定临界值,因此使用阳性预测值来评估一致性。两种检测 N-VGCC抗体阳性结果的一致性反映了参比实验的每个范围的分级PPV。



图 1 将ARUP的N-VGCC抗体检测结果与MCL检测结果进行比较。这些检测结果使用的是在开发阶段建立的参考区间[(<70.0 l="疑似,">110.0 pmol/L=阳性(实线)]和参比实验结果进行比较。MCL结果分类按PPV分层。


 特异性:用P/Q-VGCC(n=20)、VGKC复合物(包括LGI1和CASPR2)、结合型AChR、神经节AChR、NMDA、GAD65、NMDA、AQP4和ANA抗体阳性标本评估特异性。总体而言,在其他神经自身抗体或ANA抗体阳性的标本中,N-VGCC抗体RIA的特异性为87%(图2)。由于N-和P/Q-VGCC抗体先前已被证明在LEMS患者中共存,所以排除P/Q-VGCC抗体阳性标本,特异性提高到91%。疾病对照组中,有2例样本的N-VGCC抗体浓度归入疑似,其中1例AMPA抗体阳性,1例NMDA抗体阳性。对健康个体采集的血清样本进行特异性评估,观察到的特异性为97%,当排除三个疑似的结果时特异性为100%。


图 2 用其他神经自身抗体或抗核抗体阳性的样本和健康对照评估特异性。P/Q-VGCC阳性病例中抗-N-VGCC阳性对照比例最高,与文献报道一致。其他样本包括3例NMDA、3例GAD65、2例AMPA和2例AQP4抗体阳性样本。


 精密度、干扰和分析物稳定性评估:用2个阴性(5.4 pmol/L,38.7 pmol/L),2个弱阳性(130.1 pmol/L,137.8 pmol/L)和2个强阳性(402.6 pmol/L,857.6 pmol/L)进行精密度、干扰和分析物稳定性评估。精密度的评估是通过三次测定,一次测定检测样品3次(批内精密度),另外两次测定检测样品一次。三次检测的第一个结果被用于评估测定间精密度。N-VGCC的实验内和实验间变异系数均可接受。阳性标本的批内精密度和批间精密度的变异系数分别小于5%和<20%。由于阴性标本结果数值较低,观察到CV值升高。然而,由于定性结果没有改变,结果被认为是可以接受的。自ARUP实验室实施该测定以来,在每次临床运行中都测试了4个水平对照样品(平均值:15.7 pmol/L、155.5 pmol/L、197.1 pmol/L、531.5 pmol/L)。这些对照已经在9批试剂上进行了90多次检测,阳性对照的批间CV<20%,阴性对照的CV升高,但定性一致。血红蛋白浓度达1520 mg/dL、甘油三酯浓度达4474 mg/dL、游离胆红素浓度达13.75 mg/dL对结果无显著影响(阳性标本CV<15%,阴性标本定性一致)。室温保存48 h,冷藏(2~8 ℃)2周或冷冻(−20 ℃)30 天,3次以内的反复冻融对结果无显著影响(阳性标本CV<25%,阴性标本定性一致)。


02

N-VGCC和P/Q-VGCC抗体共存


对132例送检于本实验室(ARUP)的P/Q-VGCC抗体检测标本(44例阳性,37例疑似,51例阴性)进行了N-VGCC抗体与P/Q-VGCC抗体共存的检测。总体而言,13%(17/132)N-VGCC和P/Q-VGCC抗体均阳性,11%(14/132)N-VGCC抗体阳性和P/Q-VGCC抗体阴性,18%(124/132)N-VGCC抗体阴性和P/Q-VGCC抗体阳性,27%(35/132)两者均为阴性(图3)。


图 3 在ARUP先前检测过P/Q-VGCC的标本中对N-VGCC结果进行评估。A)用本研究建立的参考区间[<70.0 l="疑似,">110.0 pmol/L=阳性(实线)]和P/Q-VGCC临床检测报告中提供的结果,将N-VGCC的结果与P/Q-VGCC的结果进行比较。通过定性解释对P/Q-VGCC结果分类进行分层。B)用ARUP检测报告中提供的P/Q-VGCC参考区间[<24.6 l="疑似,">45.6 pmol/L=阳性(实线)],对按定性解释分层的N-VGCC结果类别进行反向评价。


46例N-VGCC抗体阳性标本中,37%(17/46)P/Q-VGCC抗体共存,33%(15/46)P/Q-VGCC结果疑似,30%(14/46)无P/Q-VGCC抗体共存。在44例P/Q-VGCC抗体阳性的标本中,39%(17/44)存在N-VGCC抗体,7%(3/44)具有疑似的N-VGCC结果,54%(24/44)不存在N-VGCC抗体。在N-VGCC抗体检测结果疑似的9例标本中,33%(3/9)为阳性,44%(4/9)为疑似,23%(2/9)为P/Q-VGCC抗体阴性。在P/Q-VGCC抗体检测结果疑似的37例标本中,N-VGCC抗体的检测结果为40%(15/37)为阳性,11%(4/37)为疑似,49%(18/37)为阴性。这些结果与以往报道的疑似副肿瘤性自身免疫性神经系统疾病患者中N-和P/Q-VGCC抗体共存但不完全重叠的报道一致,证实了N-VGCC抗体RIA检测N-VGCC抗体的特异性。


03

N-VGCC抗体RIA在部分患者中的应用


在用于评估APUP和MCL两家机构之间N-VGCC抗体结果一致性的156份样本中,45份(29%)的结果不一致。在19例具备临床资料的N-VGCC抗体阳性患者中,5例在两个实验室内均阳性,1例MCL结果阳性,ARUP结果疑似,9例MCL结果阳性,ARUP结果阴性,4例ARUP结果阳性,MCL结果阴性。两个实验室之间的差异主要涉及弱阳性结果。检测结果不一致的患者有自身免疫性疾病或癌症的迹象,但没有LEMS、自身免疫性脑炎或自主神经障碍的迹象。


(表一-截取上部分)

(表一-截取下部分)

表 1 两个实验室之间的差异涉及N-VGCC抗体弱阳性,这与其他免疫状况有关,主要是自身免疫,而不是LEMS或相关疾病。


对这19例具备临床资料的N-VGCC抗体阳性患者进行了P/Q-VGCC抗体水平评估,其中2例患者P/Q-VGCC抗体在两个实验室均为阳性,10例两个实验室P/Q-VGCC抗体均为阴性。1例MCL阳性但ARUP疑似(病例5),该患者患有2型糖尿病;2例ARUP阳性但MCL阴性,其中1例患有结肠癌(病例3),另1例患有干燥综合征;4例MCL阳性但ARUP阴性,分别为LEMS(病例1),体位性心动过速综合征(POTS,病例6),其他胰腺癌(病例16,在获取临床信息时死亡)


 关于N-VGCC抗体检测,MCL和ARUP两家实验室结果对比总结:基于分级PPV的实验室间定性符合率为>1.00 nmol/L (71%PPV)为100%,0.10-0.99 nmol/L   (24%PPV)为48%,0.04-0.10 nmol/L (19%PPV)为22%。阴性结果显示90%符合(n=106)。其他神经自身抗体阳性的对照组和健康对照组的特异性分别为87%和100%。在其他性能特征方面也观察到了可接受的结果。


讨论

N-VGCC抗体的存在与包括LEMS在内的多种炎症性神经自身免疫性疾病有关。虽然N-VGCC抗体的检出很罕见,但在副肿瘤抗体组中,这些抗体在15种抗体中检出率第五或第六,据报道,除了它们的诊断意义外,还具有一些预后价值。鉴于可开展N-VGCC抗体检测的机构有限,RSR Limited开发的N-VGCC抗体RIA法可填补临床需求。RSR N-VGCC RIA的性能评估显示,与行业疾病预测最佳的MCL RIA参比分析对比有很好的一致性。此外,在本次评估中,对可接受的分析性能(包括重现性、稳定性和干扰)的所有其他预定义期望均达到要求。


MCL实验室探究了N-VGCC抗体的相对浓度与它们对临床疾病谱的阳性预测值之间的关系。在这项研究中,有19例ARUP和/或MCL的N-VGCC抗体阳性患者的临床资料可用(表1)。1例(病例1)MCL(PPV) N-VGCC抗体检测结果>1.00 nmol/L(71%PPV),该患者伴有LEMS征象(ARUP检测结果为364.1pmol/L,强阳性)。9例在MCL的N-VGCC抗体结果为0.10-0.99 nmol/L(24%PPV),其中2例(22%)表现出与LEMS或自身免疫性脑炎一致的症状。这两例患者在ARUP检测时也呈阳性,并显示出在这类有临床诊断的患者中观察到的最高的N-VGCC抗体水平。5例MCL N-VGCC抗体检测结果为0.03~0.09 nmol/L(19%PPV),其中1例(20%)出现LEMS症状。这例患者在ARUP检测时也呈阳性,并显示出在这一患者亚组中观察到的最高的N-VGCC抗体水平。这五例患者中有四例有其他免疫状况,但没有一例患者的症状与LEMS或自身免疫性脑炎的诊断相符。在19例有临床病史的患者中,其余4例患者在MCL的N-VGCC抗体结果为阴性,而在ARUP呈弱阳性(病例7,16,17,19,其中病例7和 16在获取临床信息时死亡)。这4例患者都有其他免疫状况,但没有与LEMS或自身免疫性脑炎相一致的症状。


与其他文献所述一致,N-VGCC抗体与P/Q-VGCC抗体共存频率最高。使用LEMS患者血清的早期研究表明,几乎所有N-VGCC抗体阳性的样本也都有P/Q-VGCC抗体阳性,并提示这可能是由于在N-VGCC和P/Q-VGCC中发现了一个共同的表位。更多近期研究使用副肿瘤抗体评估的血清显示,N-VGCC和P/Q-VGCC抗体之间的重叠显著减少,26-27%的VGCC抗体阳性的患者在N-和P/Q-型检测呈双阳性。


这项研究同样具有局限性。它是具有一定代表性的,并受到LEMS患者样本可用性和仅有一部分患者的临床数据可用性的限制。LEMS的罕见对验证N-VGCC抗体的检测方法提出了挑战。因此,本研究没有确定N型VGCC对LEMS的检测性能。然而,这项研究中观察到的特异性反映了LEMS的估计患病率。根据现有的临床数据,两个实验室之间的差异涉及N-VGCC弱阳性结果,这些结果与其他免疫状况有关,主要为自身免疫,而不是LEMS或相关疾病。


值得注意的是,关于弱阳性N-VGCC抗体结果的特异性问题以前也曾报道过,在使用较大的抗体谱样本组进行检测时可观察到假阳性结果的频率更高。与弱阳性结果的特异性相关的问题表明,建立临界点是一个挑战,即使是对最初开发该测试的实验室也是如此。尽管N-VGCC抗体缺乏疾病特异性,但假阳性不一定是纯粹的检测问题。因此在临床实践中使用基于经验的阳性预测值。对于弱阳性结果,不同检测方法之间的一致性较差的情况并不少见。就评估自身抗体检测而言,这可能是由于检测设计(抗原、样本稀释、孵育时间等)、原理和/或缺乏标准化所致。因此,一种检测法的结果不一定能与另一种检测法的结果互通(图1D)。此外,对于N-VGCC抗体等分析物的弱阳性结果的解释受限于其低患病率、疾病谱不完整以及一些抗体出现在疾病的临床前阶段,这些现象可能会混淆对性能的评估。虽然这项研究不是为解决这些问题而设计的,但我们的数据显示了两种N-VGCC检测之间的差异,在没有完整的患者临床病史的情况下,这限制了对所描述结果的解释。在常规检测中,这些差异的实际影响及其对患者护理的影响仍将是未知的。


鲁婧怡 译,RSR TJ 校对


参考文献:Lozier, B.K., et al., Performance evaluation of a radioimmunoprecipitation assay for the detection of N-type voltage-gated calcium channel antibodies. J Immunol Methods, 2021. 496: p. 113102.


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原文标题:Performance evaluation of a radioimmunoprecipitation assay for the detection of N-type voltage-gated calcium channel antibodies  




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