乙酰胆碱受体抗体检测界值的优化及对重症肌无力诊断效能的验证

Optimization of the cut-offs in acetylcholine receptor antibodies and diagnostic performance in myasthenia gravis patients

李海峰，首都医科大学宣武医院神经内科；

邵凯，山东大学齐鲁医院（青岛）医学实验中心；

郝洪军，北京大学第一医院神经免疫实验室

乙酰胆碱受体抗体（AChRAb）是重症肌无力（MG）的主要致病性抗体，在MG的诊断、亚组分类和疗效监测中具有重要意义。

结合型AChRAb是最常检测的抗体，目前常用方法有定量的酶联免疫（ELISA）法和放射免疫沉淀（RIA）法以及半定量的细胞免疫荧光（CBA）法。无论商品化试剂盒还是实验室自主开发的in-house试剂盒，验证其临床诊断效能既是检验医生的课题，更是临床医生的课题。

在试剂盒开发过程中，往往采用从患者和对照取得的样本，明确其敏感性、特异性等检验准确性的内在指标。定量检测界值的设定对结果判断分析的影响不应忽视，应该充分考虑诊断的实际需要以及漏诊和误诊带来的问题。

抗体阴性情况下，亦可通过新斯的明试验和电生理诊断MG，但对不典型患者若仅有抗体阳性作为支持证据，则有可能误诊为MG而施以长期免疫治疗，因此设定界值时需考虑在尽可能不减少敏感性的同时特异性适度优先。MG合并其他自身免疫疾病较常见，自身免疫疾病导致的非特异性结合有可能使抗体测量值略有升高，与MG鉴别诊断的疾病中也常有自身免疫疾病。对照组的设置会影响界值的设定，纳入适合的正常对照人群和其他自身免疫疾病对照人群至关重要。

通常I期诊断试验仅有患者样本而无患者的具体信息，而MG是异质性很强的疾病，其诊断效能需要在具有不同临床特征的患者中验证。II期诊断试验纳入疾病临床谱系中不同特征者，有助于验证真实世界的诊断效能；同时因纳入健康人对照和疾病对照，在界值优化过程中也充分考虑到鉴别诊断的疾病。因此，II期诊断试验有助于同时解决上述两个问题，建立合理的检测界值并模拟真实世界人群验证其诊断效能。

检测结果有多种表达方法：ELISA法可表达为原始值（OD值）和转化值（抑制率、根据标准曲线转化而来的浓度[曲线浓度]、根据经验公式转化而来的浓度[经验浓度]），RIA法表达为原始值（cpm值）和转化值（结合率、经验浓度）。

检测界值设定可使用定性方法，其建立方法包括：

1、P/N比，为（待测样本OD值-空白对照OD值）/（阴性样本OD值-空白对照OD值），一般以P/N ≥ 2.1为阳性；

2、S/CO比，S是待测样本OD值，CO为界值（cut-off），通常取值阴性对照平均值的2.1倍，间接法S/CO比 ≥1为阳性，竞争法S/CO比 ≤1为阳性。

目前更多使用定量方法设定界值，包括：

1、主观法，包括1）符合正态分布的数据集直接使用mean ± 3SD，2）不符合正态分布的数据集使用百分位数法或转换法（转换成正态分布后计算mean ± 3SD再转换回去形成界值），3）无论是否为正态分布均使用健康对照（HC）和其他自身免疫疾病对照（OAD）的最高值（粗暴法）；

2、ROC法，通过最大Youden指数获得。

研究设计和结果

1. 患者和对照组的纳入标准和排除标准

从同期500例MG患者中通过匹配性别、年龄、病程、采集样本时受累（眼肌型、全身型、缓解）、最严重时受累（眼肌型、全身型）、伴胸腺瘤者占比以及采集样本时和最严重时的QMGs评分等关键临床特征，选取77例与真实世界人群临床特征分布相近的代表性MG患者构成研究队列。

MG符合下列诊断标准：疲劳试验阳性、新斯的明试验阳性和RNS低频递减，诊断由两名MG专家共识取得。

患者的临床特征见表1，具有与真实世界队列相似的代表性分布。

表1 纳入MG患者的临床特征

80例健康查体者作为HC，中位年龄37岁，IQR为19岁（20-68岁）。

80例其他自身免疫性疾病（OAD）患者，中位年龄47.5岁，IQR为19.75岁（25-81岁），包括视神经脊髓炎谱系疾病（n = 18）、多发性硬化（n = 11）、Guilian-Barre综合征（n = 8）、 CIDP（n = 4）、桥本甲状腺炎（n = 9）、Graves病（n = 1）、类风湿性关节炎（n = 13）、系统性红斑狼疮（n = 10）、银屑病关节炎（n = 2）、系统性硬化症（n = 1）、系统性血管炎（n = 1）、强直性脊柱炎（n = 1）和过敏性紫癜性肾炎（n = 1）。

以上包括神经免疫疾病和系统性自身免疫疾病。MG患者和对照均排除合并慢性感染性疾病者。

2. 检测方法和结果数据

使用商品化竞争性抑制ELISA试剂盒（RSR Ltd, Cardiff, UK）。在AChRAb存在下，MAb1-AChR-MAb2-/MAb3复合物的形成受到抑制，使OD值下降；血清中AChRAb浓度越高，OD值越低。抑制率计算为：100 ×（1-检测样本OD/阴性对照OD），经验浓度计算公式为：0.2 × 2^{(0.067×抑制率)}。使用商品化RIA试剂盒（RSR Ltd, Cardiff, UK）。沉淀物的放射性与AChRAb结合的放射标记AChR的量成正比。AChRAb浓度计算公式为：（检测样本cpm-阴性对照cpm）× A/（C × K × B × 2.22），其中A为碘125自生产日期到检测日期时的衰减因数，B为计数器效率，C为检测中使用血清量（μL），K为用于标记AChR时碘125标记毒素的活度（Ci/mmol）；A、C、K值将随各个批次试剂盒提供。采用Levey-Jennings质控图对每批次检测的原始值进行质控，阳性对照在mean±2SD范围内认为批次检验合格。所有检测盲法完成。

根据AChR抗体商品化ELISA和RIA试剂盒说明书提供的界值，其中一种方法判定阴性即作为AChR抗体阴性患者，使用商品化RIA试剂盒（RSR Ltd, Cardiff, UK）检测MuSK抗体，共在22例患者中检出1例MuSK抗体阳性者。

结果：所有样本均在各自检测方法的检测范围内获得检测值。提示试剂盒的检测范围可涵盖绝大多数患者和阴性对照。每批次检测阳性质控品用Levey-Jennings质控图评估后均符合质控要求。

3. 界值的优化

3.1 去离群值

OD或cpm值超过mean±3SD者判定为离群值，在HC组和OAD组各发现1例离群值：HC组（OD=1.579, cpm=623.0）抗体水平较低，考虑为偶然误差；OAD组（OD=0.985, cpm=4969.5）抗体水平较高，溯源发现为NMOSD患者，NMOSD与MG可能并发，但此例患者无MG临床表现。最终79例HC和79例OAD纳入分析。

3.2 批内和批间差异

结果：采用阳性质控品高、中、低三个浓度进行批内和批间质控，所有原始值和转化值的变异系数（CV）均< 12%，显示试剂盒检测的可重复性。

3.3 确定界值

3.3.1 正态性检验和界值建立：

采用Shapiro-Wilk检验判断原始值或转化值是否符合正态分布。正态分布的数据集采用mean+3SD或mean-3SD计算界值；非正态分布数据集采用：1）97.5%分位或2.5%分位；2）转换成正态分布数据后用转换数据计算mean± 3SD再转回作为界值。采用HC数据以及HC+OAD数据建立两套界值。用HC+OAD数据集的最小值（OD值）或cpm值及所有转化值的最大值形成一套界值（粗暴法）。从MG整组和HC+OAD组的OD或cpm值采用ROC获得Youden指数最大时的界值。

结果：

用以上方法建立的界值见表2。以HC+OAD为对照组，采用粗暴法建立的界值与用mean±3SD统计法建立的界值接近，尤其是用原始值建立的界值。

表2 转换方法、粗暴法和ROC法形成的界值

3.3.2 选择界值：

以对照组的假阳性率低且MG组的阳性率下降不多为标准选择界值。

结果：

以HC或HC+OAD作为对照，各界值的假阳性率和在MG组的真阳性率见表3。97.5%分位或2.5%分位法由于人为设定了假阳性率，获得的界值最不理想，首先排除。以mean±3SD方法建立的界值中，以HC为对照形成界值的假阳性率显著高于以HC+OAD为对照形成的界值。进一步散点图（图A、C分别为OD或cpm原始值，B、D分别为转化值）分析可见OAD个体检测到的抗体水平总体稍高于HC个体，提示自身免疫疾病的非特异性结合，证实选择HC+OAD作为对照建立界值的合理性。采用HC+OAD为对照，采用统计法mean±3SD从原始值和转化值建立的界值在对照的假阳性率为0~1.27%，在MG患者的真阳性率为74.03~77.92%。

表3 根据各界值得到的在对照个体的假阳性率和在MG患者的真阳性率

图A~D OD值、cpm值和浓度值的离散性

3.3.3 选择抗体水平的表达值

根据散点图可见，HC和OAD的浓度值的离散程度均高于原始值（OD和cpm），因此将HC的原始值和转化值的CV进行比较选择最佳抗体水平表达值。

经过转化后的数据，如果其变异较大，则有可能通过转化工作曲线或公式放大其变异性。HC人群是理论上抗体水平变异最小的人群，因此进一步在HC个体原始值的10~90%范围内等间隔选取数值计算转化值进行模拟。

结果：原始值（OD或cpm）的CV最小（表4），模拟的结果也是原始值的CV最小（表5）。因此选择原始值作为抗体定量检测的表达值，并采用其相应界值完成后续分析。

表4 HC个体的原始值和转化值的CV

表5 模拟计算得到的CV

采用原始值分析，用粗暴法建立的界值与用mean±3SD法建立的界值得到几乎一样的阳性率，进一步证实了原试剂盒采用粗暴法建立界值的合理性。但ROC法结果建立的界值虽然MG的真阳性率稍高，但对照组中的假阳性率明显增高，因此无法作为界值（表3）。

表6 在MG整组及各亚组的诊断效能（最上一行[Ref]是整组使用试剂盒界值的结果，其他均为本研究建立的界值的结果）

5. 比较ELISA法和RIA法的检测一致性

5.1使用散点图判断两种方法抗体阳性者的一致性（图E）

5.2 Spearmen秩相关判断两种方法抗体定量的一致性

结果：MG整组OD值和cpm值具有良好相关性（r_s=-0.92, 95%CI: -0.95~-0.88, p<0.01, n=77）（图F），用两种方法检测均判为AChRAb阳性者也有良好相关性（r_s=-0.84, 95%CI: -0.91~-0.74, p<0.01, n=55）。

图E 散点图判断AChRAb阳性者的一致性   图F AChRAb定量值的相关性

5.3 定性判断两种方法的检测一致性

分别用ROC曲线、Kappa检验和McNemar卡方检验判断两种方法的检测一致性。

结果：ROC曲线显示ELISA和RIA法检测抗体阳性者间有良好的一致性（图G，ELISA的AUC 95%CI: 0.89~0.97，RIA的AUC 95%CI: 0.90~0.98）。采用mean±3SD法建立的界值，阳性者在MG整组及其亚组均有中到高度的一致性，McNemar检验，p均>0.05；Kappa检验，加权к为 0.71~1.00，p均<0.01（表7）。采用ROC法建立的界值在MG整组的阳性者一致性较差，McNemar检验，p<0.01；加权к为0.66，p<0.01。

表7 各组患者用两种方法判断AChRAb阳性率的一致性及组间差异

图G ROC法比较抗体阳性的一致性    图H和I 双图ROC法进行抗体阳性者的一致性分析

5.4 两种方法检测不一致者的分析

观察MG患者两种方法检测判断抗体阳性的一致性，并用双图ROC法判断不一致者是否落在灰区内。灰区指临界值，取界值相应的敏感性和特异性两侧的10%为临界（图H和I）。

结果：55名MG患者ELISA和RIA法均为阳性，18名患者两种方法均为阴性，4名（7.3%）患者在阳性判断不一致。两名患者ELISA法（OD 1.59和1.60，界值≤1.79）判为阳性而RIA法（cpm 1105.50和1179.00，界值≥1234.12）判为阴性。两名患者ELISA法（OD 1.88和2.02）判为阴性而RIA法（cpm 2211.50和2769.00）判为阳性。落在灰区中者ELISA法10例，RIA法15例。两种方法不一致者落在灰区中的ELISA法4例，RIA法3例。

两种检测方法阳性者的不一致主要来自检测灰区（即临界值范围）。

6. 抗体水平与MG临床特征间的关系

6.1 各临床特征亚组两种方法判断AChRAb阳性者的差异

结果：以年龄、性别、胸腺瘤、采集样本时的肌肉受累和严重程度（QMG_S评分）分组，结果见表7。采样时全身型和严重者的阳性率显著高于其对应亚组。

6.2 各临床特征亚组AChRAb水平的差异

结果：各亚组的两种方法的定量检测值见图J和L。年龄大、伴胸腺瘤、采样时全身型及严重者的AChRAb水平高于其对应亚组。

图J和图L   ELISA法和RIA法定量检测值在不同亚组间的差异

6.3 QMGs与抗体水平的相关性

结果：在两种方法检测均判为阳性者（n=55），ELISA法（r_s=-0.60，95%CI -0.75~-0.39， p<0.01）和RIA法（r_s=0.57，95%CI 0.36~0.73，p<0.01）检测的抗体水平与QMGs中度相关。

图K和M AChRAb阳性者ELISA法和RIA法检测值与QMGs的相关性

优势和不足

1. 优势：

（1）以HC+OAD为对照，采用系统化的方法优化定量检测的界值。

（2）采用主要临床特征代表性的抽样人群，并在MG整组及亚组验证界值的诊断效力。

（3）详细分析阳性者和检测值与临床特征的关系。

2、不足

（1）OAD对照不是MG的常见鉴别诊断疾病。但多数鉴别诊断疾病可通过病史、神经系统检查和其他实验室检查来鉴别，而本研究设置OAD对照的目的是消除自身免疫背景所致的非特异性结合。

（2）HC和OAD组的样本量较小。但给我们分析数据正态分布与界值关系提供了良好的机会，通过转换成正态分布，我们建立的界值获得了良好的诊断效力。

编辑：李尊波/谢琰臣；顾问：许贤豪。

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