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TSHR及TRAb研究的实际应用
发布时间:2022-07-27   点击次数:63次

 

 

促甲状腺激素受体(TSH Receptor,TSHR)在体内外场景中均具有广泛的应用。人抗TSHR单克隆抗体可用于TSHR自身抗体(TRAb)的检测,有助于自身免疫性甲状腺疾病的诊断和治疗。这些TSHR单抗中,以M22™代替现有检测法中的TSH是目前灵敏度和特异性*高的检测方法。目前实现商品化的M22™已作为世界卫生组织促甲状腺抗体的国际参考物质,用于TRAb检测方法的校准。

 

具备热稳定性的TSHR胞外结构域,可在体外环境中稳定结合患者血清中的TRAb,这为提高TRAb检测法的特异性带来积极的实用价值。除此之外,人TSHR单克隆抗体作为新的治疗手段也有很好的前景,有望辅助控制Graves病、Graves眼病和甲状腺癌患者体内的TSHR活性。

 

 

 

背景


 

早在1956年,Adams和Purves就shou次报道了甲状腺疾病患者血清中,存在与TSH不同的长效甲状腺刺激因子(LATS) [1]。当时研究发现LATS刺激甲状腺的机制与血清蛋白的IgG部分相关。1974年,RSR创始人Smith博士与Hall的联合研究证实了Graves病患者血清中这种因子实质上是特异性靶向TSHR的自身抗体(即TRAb),而TRAb对TSHR的刺激是造成Graves病患者甲状腺功能亢进的病因[2]。这一研究结果促进了第一代TRAb体外检测方法的发展,为自身免疫性甲状腺疾病(AITD)的辅助诊断和管理提供依据。


TSHR研究的下一个重要里程碑是1989 - 1990年,在四个独立实验室中克隆了TSHR基因[3-7]。这为TSHR单克隆抗体的体外制备提供更多基础。


2003年,Smith博士从一名Graves病患者的外周血淋巴细胞中,分离出促甲状腺激素受体单克隆自身抗体(称为M22™)[8]。随后发现的多种TSHR单克隆自身抗体中,按生理功能又可为两种阻断型单抗(5C9和K1-70)和一种刺激型单抗(K1-18)[9]。重组TSHR基因表达技术的发展,配合目前已发现的TSHR单抗,使TSHR富亮氨酸重复结构域(LRD)可与M22和K1-70的Fab片段结合为抗原抗体复合物,以结晶形式得以提取[10,11]。这为后续研究中TSHR LRD与两种不同效应的单克隆抗体间分子的相互作用提供助益[10,11]。

 

当前多项研究成果证实,体外环境中的小鼠胚胎干细胞可以通过TSH刺激,定向转化为功能正常的甲状腺滤泡细胞。这为长期接受激素替代治疗的甲状腺疾病患者,开辟了功能恢复性治疗的新前景[12,13]。我们在近期的研究中还建立了Graves眼病(GO)的小鼠模型[14],并制备了具有热稳定性的TSHR LRD制剂,shou次解析了无配体的糖蛋白激素受体结构域的晶体结构(2.83 Å分辨率)[15]。这些重大的科学结果不断促进对AITD患者诊断、监测以及管理的改进。

 

TRAb的体外应用实例

 

如上所述,在Graves病发病机制中,患者血清中的自身抗体对TSHR的刺激起核心作用。因TRAb检测的重要性,TRAb的检测方法也历经了多代的发展:

 

一代检测:

液相检测法,利用血清TRAb可以抑制放射性I-125标记的TSH与TSHR相结合的特性,使用聚乙二醇将抗原抗体复合物沉淀[16]。该检测法是Graves病诊断的一个里程碑。在早期开展的生物检测法中,通常以刺激型抗体TSAB或TSH对表达TSHR的活细胞进行刺激,以其产生的第二信使cAMP作为检测标志物来间接检测TRAb。该试验法耗时较久且流程复杂,不适宜大规模检测。一代液相法作为替代方案改变了这一局面。

 

二代检测:

第二代检测改为固相检测法,样品中的TRAb与固定在ELISA微孔或塑料管上的TSHR相结合,随后与生物素或I-125标记的TSH反应实现检测[17]。固相检测法实现了非放射性同位素标记和检测自动化,与第一代检测法相比,提高了方法学的灵敏度和特异性。

 

三代检测:

在新的第三代检测中,以M22-生物素替代二代检测中的TSH-生物素,从而进一步提高了灵敏度和特异性[18]。与二代检测中TSH与TSHR间的结合相比,M22因其复合物不易解离,在TRAb的竞争抑制法检测中更具有优势。这一特性使配体在严格的洗涤步骤里保持紧密结合,使其更适合用于自动化检测系统。第三代TRAb检测目前在各地的各个平台上广泛应用。即使检测时长控制在半小时内,也能保持良好的灵敏度和特异性[18,19]。

 

TRAb的浓度通常以IU/L表示,单位定义参考了国家生物标准和控制研究所(NIBSC)提供的世界卫生组织(WHO)标准物质。该类物质通常用于TRAb检测方法的校准。第一代标准物质(编号90/672)源自一位患者的捐赠。随着第一代标准物质的耗竭,M22™的开发诞生了第二代国际标准物质(编号08/204)。在NIBSC 08/204标准物质中,每支安瓿的正常人血清中含有1 μg冻干M22 IgG。当前M22™已规模化投产,实现了从实验室研究向产业化生产的转变。(RSRTJ解读:保证了M22的产出及供应问题。)

 

TSHR的体外应用实例

 

作为甲状腺自身抗体的靶抗原之一,TSHR固有的不稳定性和难以纯化是阻碍其大规模应用的难点。(RSRTJ解读:生产厂家常见问题)RSR利用M22或K1-70两款单抗的 Fab片段对TSHR LRD部分进行稳定化,克服了上述困难,从而进一步探究两种抗原抗体复合物的分子结构[10,11]。受限于游离TSHR较差的稳定性,我们至今未能成功纯化游离态TSHR LRD。因此通过系统性诱发定向突变,获取热稳定性抗原蛋白的策略已证明其价值。RSR对人TSHR片段22 - 260 (TSHR260)序列中的氨基酸进行系统性突变,并对突变蛋白在42℃条件下的热稳定性进行了测试。经过一系列筛选和重组,我们最终获得包含六处突变的强热稳定性TSHR。该突变抗原命名为TSHR260-JMG55,其稳定性约为野生型TSHR260的900倍[15]。(RSRTJ解读:RSR新品-TRAb SPEC试剂盒采用了该原料。)

 

用TSHR260-JMG55替换对应片段后的全长TSHR,无论是对TSH或M22的刺激信号反馈,还是结合Graves病患者的TSHR自身抗体时,耐热型TSHR均与野生型TSHR的性能表现接近[15]。这些试验均证实,耐热突变不影响TSHR本身的抗原性。

 

实战应用

稳定的浓缩TSHR260-JMG55制剂可用于TRAb检测法的特异性确认。当送检样品中TRAb检测结果不明确时,使用TSHR260-JMG55制剂与待确认样本共同孵育可实现特异性确认试验。如果测试样品中存在TRAb,则被TSHR260-JMG55结合,结合处理后抗体水平降低的现象,可解读为抗体阳性。(RSRTJ解读:RSR新品-TRAb SPEC试剂盒的检测原理。)此外,耐热的纯化TSHR260-JMG55也可用于TRAb新检测法的研发。

 

TSHR的体内应用研究

 

 

在目前的设想中,稳定的TSHR制剂可以对患者体内的血清TRAb特异性免疫吸附。在需要从患者外周循环中紧急清除TRAb的危急临床危重情况下,通过TRAb与TSHR260-JMG55结合的机制,将TRAb从患者血浆中分离,从而提供快速有效的治疗效果。

 

 

TSHR阻断型人单抗K1-70是一种针对TSH和刺激型抗体产生刺激信号的“天然”强抑制剂[20]。K1-70用于人体可实现对Graves病和Graves眼病(GO)中的甲状腺功能亢进的控制,以及对甲状腺癌的病程进展产生潜在的收益[21-23]。此外,利用K1-70对TSHR的高亲和性和特异性,可能有助于组织影像学和辅助药物进行靶向定位。(RSRTJ解读:原料 K1-70的扩展应用)

 

 

肿瘤治疗展望

 

在甲状腺癌的控制策略上也可提供新思路:通过一种含TSH片段的纳米脂质体,装载化疗药物后靶向到达病灶处的TSHR[24]。另一种方法基于TSHR结合碳纳米管,这种纳米管能将外部光能转化为热能,从而在局部杀死癌细胞[25]。此外,针对TSHR的小分子拮抗剂,通过抑制信号通路的方法来抑制甲状腺癌进展[26]。目前在Graves病患者的临床试验中,采用K1-70单次递增剂量给药,已开展涉及安全性、耐受性、药代动力学和药效学的I期临床研究(结果已于22年发表)。

 

K1-70药用化实例


一名患有Graves病、严重GO和局部晚期伴远端转移的高分化甲状腺滤泡癌的女性患者,曾接受了K1-70作为药物的药效观察[27,28]。给药前该患者GO临床活动评分(CAS)为6/7,复视,双眼突出量21 mm,伴水肿、眼睑肿胀、眼球运动时疼痛、眼睑红斑。她开始接受为期3周,个体化定制剂量的K1-70用药,旨在中和她体内高水平的促甲状腺刺激型自身抗体。第一次给药时TRAb为130 IU/L,甲状腺刺激活性>2000%。该患者同时服用乐伐替尼治疗甲状腺癌。患者反馈称在开始K1-70治疗后不久,她的眼部症状有所改善;CAS提高到0-1/7,双侧突出量改善为19 mm,可通过手术矫正复视。接受K1-70治疗期间,患者恢复了驾驶能力,GO一并转入稳定期。在乐伐替尼因副作用而停药期间,仅K1-70单独用药,也观察到肿瘤进展放缓。在持续K1-70治疗2年且剂量提高至120 mg/次时,该患者身上仍未观察到不良反应。

 

这些早期研究表明,用K1-70阻断TSHR活性的体内治疗方式,在控制Graves病、GO和甲状腺癌中甲状腺功能亢进上具有广阔的应用前景。

 

 

 

更多关于RSR厂家抗体的介绍:RSR甲状腺自身免疫系列抗原抗体

 

 

 

参考文献:Furmaniak, J., et al. "Practical applications of studies on the TSH receptor and TSH receptor autoantibodies." Endocrine 68.2 (2020): 261-264.    

 

 

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