胰岛细胞抗原-2自身抗体 (IA-2A)是预测和诊断1型糖尿病的重要血清学标记物。国际上的糖尿病自身抗体标准化程序(DASP)及胰岛自身抗体标准化程序(IASP)可用于规范和提高实验室之间的抗胰岛自身抗体检测性能[1-2]。RSR公司生产的IA-2A检测试剂盒（包括放射免疫法RSR-RIA和酶联免疫法RSR-ELISA)经DASP评估，检测性能优异，具有较高的灵敏度和特异性，证实是可用于临床的成熟商品化试剂盒，并在世界各地被广泛使用[1]。最近，日本IA-2A的测定已完成方法学的升级，从RSR-RIA转为RSR-ELISA。本研究作为日本糖尿病学会1型糖尿病委员会的一项研究项目，旨在采用两种检测方法对日本1型糖尿病患者中IA-2A进行测定，并对患者的临床特征进行研究。
材料与方法
从10个参与研究机构收集了343份1型糖尿病(T1DM)患者血清样本，包含暴发性1型糖尿病患者38例，急性发作型1型糖尿病患者168例，缓慢进展型1型糖尿病(SPIDDM)患者137例。
表1 入组患者临床特征
胰岛自身抗体的检测均采用RSR公司生产的检测试剂盒。其中RSR-ELISA IA-2A试剂盒在IASP2018评估中，灵敏度72%，特异性98%。RSR-ELISA GADA试剂盒在IASP2018评估中，灵敏度90%，特异性98%。
根据RIA法和ELISA法测定IA-2抗体的结果，将患者分为4组：
第一组：RIA+ ELISA+；第二组：RIA+ ELISA-
第三组：RIA- ELISA+；第四组：RIA- ELISA-
结果
1. IA-2A-RIA和IA-2A-ELISA的检测结果和一致性
38例暴发性T1DM中，共测得2例IA-2A阳性（ELISA法2例，RIA法0例）；168例急性发作型T1DM中，共测得90例IA-2A阳性（ELISA法77例，RIA法85例）；137例缓慢进展型T1DM中，共测得46例IA-2A阳性（ELISA法37例，RIA法42例）。
表2 IA-2A-RIA和IA-2A-ELISA测定结果一致性
图1 IA-2A-RIA和IA-2A-ELISA检测结果。(a)急性发作型T1DM (b)缓慢进展型T1DM
采用线性回归和指数回归对两种检测方法的测定结果进行曲线拟合分析，以确定二者相关性的最佳拟合。指数回归模型对急性发作型和缓慢进展型T1DM的拟合效果优于其他模型(图2)。
图2 IA-2A-RIA和IA-2A-ELISA检测结果的相关性分析。(a)急性发作型T1DM (b)缓慢进展型T1DM
2. 急性发作型T1DM的临床和免疫遗传学特征
168例急性发作型T1DM患者的临床特征见表3。第一组(RIA+ ELISA+)IA-2A平均水平显著高于第二组(p<0.0001)和第三组(p=0.012)。另外谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)的检出率存在显著差异，IA-2A-RIA阳性组高于IA-2A-RIA阴性组(p=0.0047)，IA-2A-ELISA阳性组高于IA-2A-ELISA阴性组(P=0.0039)。
表3 168例急性发作型T1DM不同分组的临床特征
注：NS表示无显著差异
3. 缓慢进展型T1DM的临床和免疫遗传学特征
137例缓慢进展型T1DM不同分组患者的临床特征见表4。与急性发作型T1DM类似，第一组的IA-2A水平显著高于第二组和第三组；GADA在4组中存在显著差异。除此之外，第四组的病程显著长于第一组。IA-2-Ab-ELISA阳性患者的空腹C肽水平显著低于IA-2-Ab-ELISA阴性患者(P=0.006)，而IA-2-Ab-RIA阳性患者与IA-2-Ab-RIA阴性患者无差异。HLA-DRB1*09:01与IA-2A-ELISA阳性相关(p=0.0004)。
表4 137例缓慢进展型T1DM不同分组患者的临床特征
注：NS表示无显著差异；*与第一组比p<0.005；**与第一组比p<0.05；NA表示不适用。
4. 缓慢进展型T1DM病程与抗体检出率和抗体水平的关系
诊断患者归属缓慢进展性T1DM时，需要在病程中检测出一种或多种自身抗体(主要是GADA)，但在病程较长的患者中自身抗体可能无法被检出。因此，我们研究了缓慢进展型T1DM患者的病程与自身抗体检出率和抗体水平之间的关系。GADA的检出率高于IA-2A的检出率（RIA法和ELISA法）。但GADA和IA-2A（RIA法和ELISA法）的检出率均随病程延长呈现出下降趋势(图3)。因此，在病程≥5年的患者中，缓慢进展型T1DM的诊断灵敏度降低至51%。在自身抗体阳性患者中，自身抗体水平的变化不受病程因素的影响。
图3 缓慢进展型T1DM患者抗胰岛自身抗体阳性与糖尿病病程的相关性
5. 缓慢进展型T1DM患者中，进展至胰岛素缺乏状态与IA-2A阳性的相关性研究
IA-2A-ELISA结果与缓慢进展型T1DM患者内源性胰岛素分泌降低有关，我们分析了57例缓慢进展型T1DM患者的空腹C肽(F-CPR)的变化。自入组3年以来，57例患者中32例(56%)进展到胰岛素缺乏状态(F-CPR <0.6 ng/mL)。表5显示了进展者和未进展者的临床特征。
表5 缓慢进展型T1DM患者进展到胰岛素缺乏状态者和未进展者的临床特征
6. IA-2A-RIA和IA-2A-ELISA检测结果差异研究
为了阐明RIA法和ELISA法两种检测方法对IA-2A的结果差异是否与IA-2抗原的非特异性结合有关，我们用未标记的重组IA-2蛋白进行竞争性结合实验。对第2组(RIA+ELISA-)中31份血清和第1组(RIA+ELISA+)中22份血清进行了RSR-RIA检测，对第3组(RIA-ELISA+)中12份血清和第1组(RIA+ELISA+)中19份血清进行了RSR-ELISA检测。RIA法对第2组和第1组的抑制率分别为91.3±10.4%和93.9±5.7%；ELISA法对第3组和第1组的抑制率分别为97.7±7.8%和100.0±0.0%。此外，在加入250 ug/mL的未标记IA-2蛋白后，所有血清中IA-2A水平的检测结果变为阴性。竞争分析实验表明，在RIA和ELISA结果存在差异的血清中确实存在IA-2特异性自身抗体。
结论
在本研究中，我们发现：
(i) IA-2A-ELISA和IA-2A-RIA两种方法的一致性很好。
(ii) 对缓慢进展型T1DM患者而言，ELISA法检测更适合用于早期识别胰岛素缺乏状态的疾病进展趋势。
(iii) IA-2A-ELISA是一种适合的RIA替代方法，可用于急性发作型T1DM和缓慢进展型T1DM患者的诊断。
综上所述，IA-2A不仅是诊断1型糖尿病的可靠标记物，而且可以预测缓慢进展型T1DM的疾病进展。与IA-2A-RIA相比，使用ELISA检测IA-2A可能有助于临床更早识别可能进展到胰岛素缺乏状态的缓慢进展型T1DM患者这一亚型。
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参考文献：Kawasaki E, Shimada A, Imagawa A, Abiru N, Awata T, Oikawa Y, Osawa H, Kawabata Y, Kozawa J, Kobayashi T, Takahashi K, Chujo D, Fukui T, Miura J, Yasuda K, Yasuda H, Kajio H, Hanafusa T, Ikegami H; Committee of type 1 diabetes, Japan Diabetes Society. Comparing the clinical significance and antigen specificity of insulinoma-associated antigen-2 autoantibodies between radioimmunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay in Japanese patients with type 1 diabetes. J Diabetes Investig. 2022 Sep 30.
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