ELISA检测原理

    酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA）指将抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的有无深浅定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

01

ELISA常见分类

#1

直接ELISA

特点： 在直接ELISA中，被测抗原被固定在多孔板表面，用一种针对该抗原的抗体检测，该抗体直接与HRP或其他检测分子结合。

优点：简单快速，避免交叉反应。

缺点：潜在高背景，没有信号放大。

#2

间接ELISA

特点：固相载体包被抗原，酶标记二抗，主要用于测抗体。 

优点：使用酶标二抗增加了灵敏度，灵活大，成本低。 

缺点：交叉反应几率升高。

用途：通过检测血清中的抗体来检测病毒，如第1，2代艾滋病诊断试剂。常用于免疫动物血清中抗体含量的测定。

#3

夹心法ELISA(双抗体，双抗原）

双抗体夹心ELISA法

特点：使用两个特异性单抗或者1个特异性单抗和1个特异性多抗，固相载体包被抗体，酶标记特异性抗体作为检测抗体。

优点：使用两个特异性抗体检测，特异性好。

缺点：成本高。

用途：用于抗原的定量检测。

双抗原夹心ELISA法

特点：使用两个特异性抗原，固相载体包被特异性抗原，酶标记特异性抗原作为检测抗原，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。

优点：灵敏度、特异性高于间接法

缺点：反应时间略长于间接法 

用途：用于抗体的定量检测。

*RSR多款试剂盒采用桥式ELISA法（基于双抗原夹心法原理），保证抗体检测的高特异、高灵敏性。

#4

竞争ELISA

特点：包被抗体，标记抗原，样本中的抗原与酶标抗原竞争与固相抗体结合，标本中抗原含量越多，结合在固相上的酶标抗原越少，最后的显色也越浅。

注意：该原理强调抗原与抗体的充分结合，因此温度、摇床（振速、振幅）、反应时间等因素值得注意！

用途：小分子抗原或者半抗原的定量检测，当抗原材料中干扰物质不易去除或不易得到足够的纯化抗原时，多用于此方法检测；一般小分子激素及药物常用此法测定。

* RSR旗下AChR Ab-ELISA、TRAb 2nd-ELISA、TRAb 3rd-ELISA等都是基于竞争法ELISA的原理基础上设计的试剂盒，是该项目ELISA定量检测方法，特异性均达到99%以上。

02

ELISA常见问题

Q1

为什么推荐两个主波长检测

(450nm和405nm)？

A: ELISA实验终止后形成的是黄色物质，该物质需要在450nm处测定其吸光度，当OD450值≥3时，应使用OD405的值进行转换（乘转换系数3.4，参见说明书）。

RSR试剂盒中设计的空白孔属于试剂空白，建议按照“空白孔+两次单波长检测（405nm & 450nm）"完成实验，无需再设置参考波长（630nm）。

Q2

CV值指的是什么？

A: CV值是统计学中的一个概念，中文是变异系数，可以认为变异系数和极差、标准差和方差一样，都是反映数据离散程度的绝对值。CV值越小，说明数据的波动程度越小。在描述板内、板间实验结果是否一致时常用到CV值，其越小，说明批内及批间差越小，试剂盒质量越好。

Q3

标曲拟合方式的最佳方法？

A: 

ELISA数据处理中所谓的“标准曲线"其实更适合称为拟合曲线。标准曲线应根据不同待测物质的特性和检测范围选择适当的拟合方式。除常见的直线、多项式曲线、指数曲线、对数曲线等外，四参数Logistic回归和三次样条插值cubic spline拟合对定量范围内全域具有更良好的适用性，能够比较精确的反映浓度和吸光度间的转换关系，从而进一步准确获得样品中待测物质的浓度值。

在RSR试剂盒中，拟合方式可根据产品说明书自行选择4 parameters（四参数Logistic曲线）或cubic spline（三次样条/仿样曲线/样条曲线等），通过酶标仪搭配的计算软件完成数据的处理，从而快速、准确地完成定量检测。

Q4

ELISA试剂盒只能检测血清、血浆、

细胞上清液吗？

A: 通常我们可用于ELISA检测的样本是有多种类型的，在使用前应留意试剂盒匹配的样本类型，包括血清、血浆、脑脊液等常规样品，以及尿液、细组织匀浆液、细胞裂解液等样品。对于超出试剂盒适用样本类型的样本，市面上很多厂家的产品都没有相关的验证数据，客户如有需要可以自行测试。需要注意的是，不同类型的检测样本前期的处理方法是不一样的。样品中含有影响生物活性的物质会影响检测结果。

Q5

试剂盒在使用前要室温放置30min，

目的是什么？

A: ELISA试剂盒对于温度的要求比较严格，温度是ELISA结合反应的重要影响因素，这样做主要是为了使试剂温度一致，在后面的温育反应步骤中，能使反应微孔内的温度能较快地满足测定要求。

Q6

样本收集后不能及时检测，低温保存

可以放多久？

A: 样本收集后应尽快检测。如果样本收集后不能立即检测时：一周内可检测则需将样本置于4℃环境下，冷藏保存。3年内检测则需将样本至于-20℃或更低温度环境下保存。

Q7

样品反复冻融影响大吗？

A:样品反复冻融对蛋白影响非常大，能导致蛋白降解，非常不建议反复冻融样品。一般蛋白含量丰富的样本例如血清/血浆反复冻融1-2次，对于检测结果影响不是非常大。

Q8

生物素化制剂和酶结合物，稀释后没用完，

还可以再用吗？

A: 复溶的生物素化制剂和酶结合物建议依据使用说明书内的有效期和储存条件使用，放置时间太长可能会影响其活性。可根据自己实验所需用量进行配制，不建议过量配制。

Q9

振荡器的选择

A: 建议采用酶标板振荡器(单板/多板)，保持震荡速率在500 shakes/min。定轨摇床因速率过慢，不建议使用。

当所用产品的检测原理为竞争ELISA法时，振荡器的轨道直径（振幅）更加重要。选好振荡器能够确保在竞争法ELISA中抗原与抗体的充分结合，才能得到理想结果。RSR采用德国IKA MTS 2/4振荡器，如下图所示。

该产品轨道直径3mm，支持1-4个ELISA板同时振荡，且能够确保微孔板在振荡时既不会松脱也不会有液体飞溅。当您不确定实验室的振荡器是否满足ELISA实验规定时，可进行预实验以确保得到稳定重现性。但这种测试费时费板，建议选择相关参数的振荡器。

Q10

变异系数(CV)较大的原因？

A: 

Q11

标准曲线较差？

A: 

* 振荡器的振速与振幅也不容忽视，根据实验需要调整振荡器参数或更换符合标准的振荡器。

** RSR ELISA试剂盒标准品可直接使用，避免标准品稀释、复溶不当等操作失误。

Q12

高背景或阴性对照值偏高

A: 

*工作台用漂白剂做过清洁：残留漂白剂可以氧化TMB导致非特异性高信号，需要去除残留

Q13

显色信号弱

A: 

Q14

无显色信号

A: 

Q15

标曲佳但样品孔无信号

A: