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竞争法ELISA及其操作细节
发布时间:2021-09-08   点击次数:604次

竞争法ELISA


“这个竞争法ELISA试剂盒总是做不好,数据好奇怪啊" 让小编带你走进竞争法ELISA的小世界,揭秘做好竞争法ELISA检测的小技巧和小细节。

小概念:

直接竞争法:将捕获抗体固化在微孔板上,加入酶标记抗原与待测样本,若待测样本中含有抗原,则与酶标记抗原竞争结合孔板上的捕获抗体。

间接竞争法:将捕获抗原固化在微孔板上,加入酶标记抗体与待测样本,若待测样本中含有抗原,则与孔板上的固化捕获抗原竞争结合酶标记抗体。


竞争法ELISA检测目标:

   抗体、抗原、蛋白、代谢产物

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试剂盒的关键:(以直接竞争法为例)

  1. 捕获目的蛋白的抗体

  2. 使试剂显色的酶标记抗原

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ELISA孔板设计


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ELISA孔板经特殊设计,可以使各种蛋白及抗体高亲和地附着在孔板内。


竞争法ELISA是如何实现检测的?

(以直接竞争法为例)


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   首先,微孔板预包被了捕获抗体,并用BSA对微孔板进行封闭处理,这样做的目的是避免非特异性结合的产生,降低背景信号,增加特异性。

 

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   将样品与试剂盒中的酶标抗原充分预混合后,将混合物加入到微孔板中。酶标抗原与样品中的目的蛋白可以和捕获抗体上同一个表位竞争性结合。(*这一步不同于其他方法)



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   经过抗原和抗体的充分结合后,样品中的目的蛋白以及试剂盒的部分酶标抗原分别与固定在微孔板上的捕获抗体结合,再通过清洗,洗涤走未结合的酶标抗原和其他非目的蛋白,最后通过TMB进行显色。


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   当样品目的蛋白含量远远大于酶标抗原含量时,最终结合在微孔板上的酶结合物相对较少,从而显色信号弱(上图左。)

   当样品目的蛋白含量远远小于酶标抗原含量时,最终结合在微孔板上的酶结合物相对较多,从而显色信号强(上图右。)

   因此检测蛋白的含量多少与最终检测信号值的强弱成反比。


竞争法ELISA的小细节

上个板块,小编带你们回顾了下竞争法ELISA的基本检测原理,可以看出保证混合物(样品+酶结合蛋白)与捕获蛋白的充分反应和结合是竞争法ELISA成功的关键。接下来,我们讲一下实际操作中影响该环节的一些小细节。


01

实验温度

    实验温度会影响微观分子运动的速率以及活化分子比率。温度越高,微观分子运动增加,分子碰撞次数增加,活化分子比率增加。

   同样对于酶参与的催化反应,过高或过低温度都会影响酶的活性,从而影响反应效率。

   建议:参看产品使用说明,严格按照产品说明推荐温度操作实验。

02

振荡器的选择与参数设定

竞争法ELISA离不开振荡器的使用。

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   为什么振荡器对实验如此重要呢?让小编带你走进微观世界的ELISA检测(如上图)。

   从微观的角度上,固相与液相之间会形成一层具有边界效应的界面,称为边界层,这个层面在一定程度上会影响抗原与抗体的充分结合。而振荡器就能够起到打破边界层的阻碍效果,辅助抗原抗体更加充分结合。

   通常情况下,大家常常关注到振荡器的转速,也就是500 rpm,然而另一个重要细节往往会被忽略——轨道直径。

   轨道直径 ,又称振幅,也就是托盘振荡一圈时的直径。根据天津阿斯尔生物科技有限公司的实验经验,当振荡器振速或振幅不足时,可能会造成整体OD值偏低的结果。当振幅过大时,可能会造成微孔板内液体飞溅、样品孔污染,进而影响实验结果的准确性。

   英国RSR开发总部使用的是德国IKA MTS 2/4振荡器,如下图所示。

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   该产品轨道直径3mm,支持1-4个ELISA板同时振荡,且能够确保微孔板在振荡时既不会松脱也不会有液体飞溅。

   经过RSR TJ的实验验证,美国精骐振荡器HYQ-3111同样满足RSR旗下竞争法ELISA试剂盒的实验需求。(转速200~3000rpm,振幅4.5mm)。当您不确定实验室的振荡器是否满足ELISA实验规定时,可进行预实验以确保得到稳定重现性。

   小小振荡器,却藏有这么多不可忽略的小细节,进而影响到最终实验的成败。因此当我们准备实验的时候,认真遵循说明书,如果能对实验的基本原理了解透彻,可以更加保证结果的准确。



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