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水通道蛋白4自身抗体ELISA检测方法:诊断准确性和临床相关性
发布时间:2021-12-06   点击次数:216次
文章来源于罕见病信息网,译:田璟鸾    校:黄娟


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1. 背景



视神经脊髓炎(NMO)是一种中枢神经系统的自身免疫脱髓鞘疾病,主要累及视神经和脊髓,其特征是患者血清中存在水通道蛋白4抗体。2004年,梅奥诊所的研究团队初次在NMO患者血清中发现了一种特异性的、在小鼠大脑的血脑屏障处或附近结合的NMO -免疫球蛋白G(IgG)。2005年,NMO-IgG的抗原决定簇被鉴定为水通道蛋白4(AQP4),一种在血脑屏障的星形胶质细胞足突中密集表达的水通道蛋白。

AQP4有两种主要的异构体,M1异构体:全长323个氨基酸,翻译起始点在Met-1,M23异构体:较短的301个氨基酸,翻译起始位点为Met-23。这两种异构体有22个n端胞质氨基酸的差异,虽然不是AQP4抗体的靶点,但影响细胞表面蛋白质的四级结构。两种异构体均可组装成四聚体AQP4;但只有M23异构体在细胞膜上以规则的方形排列,称为正交四聚体(OAP)。

2006年,血清中水通道蛋白4抗体的阳性检测结果已纳入修订的NMO诊断标准。因此,一种灵敏度高、特异性强的水通道蛋白4抗体检测方法对于诊断和治疗这种神经系统疾病具有重要的临床意义。

自从发现抗AQP4抗体以来,已经提出了几种检测方法,包括对小鼠、大鼠或灵长类组织的各种冷冻切片进行间接免疫荧光法(IIF),转染细胞表达人AQP4的IIF,通过荧光显微镜来直观定量(CBA)或通过流式细胞术(FACS);以及酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫沉淀法(RIPA)和荧光免疫沉淀法(FIPA)检测部分纯化的AQP4。然而,这些方法的诊断准确性(如灵敏度和特异性)差异很大。许多技术方面的因素可能会影响测定准确性,包括所使用的切片的类型和种类,转染和固定方法,AQP4的物种和异构体。

目前,CBA平均诊断准确率为76.5%,明显高于其他方法(48.5-62.3%)。然而,CBA仅提供半定量结果,结果判读依赖于观察者,尤其是测定血清抗体滴度时存在劳动强度大,耗时长的缺陷。

基于蛋白质的检测方法,如ELISA法,可能解决上述这些技术问题:易于使用,可大样本量分析,并可实现自动化检测。

Hayakawa等(2008)第一次以重组大鼠AQP4为包被抗原,采用ELISA法直接检测血清AQP4抗体。而Kim等(2012)以人的AQP4作为包被抗原的ELISA法获得相似灵敏度,但特异性更高。此后不久,RSR有限公司(Cardiff, UK) 使用M1-AQP4异构体研制出第一款商用ELISA试剂盒,但据Isobe(48.3%),Fryer(58%)和Jarius(78.5%)等报道的该款ELISA检测灵敏度,还不能作为一个有效的CBA替代方案。

最近,RSR有限公司开发了一种新版的基于人类重组AQP4 M23异构体的ELISA检测方法。本研究旨在评价这种新型M23-ELISA产品在全自动检测系统上的分析和临床准确性。
  



2. 材料与方法


2.1 病例



从4个意大利境内中心收集了64例NMOSD患者(24例NMO, 24例LETM, 13例单独ON, 3例脊髓炎) 和27例对照组(17例多发性硬化(MS)和10例健康受试者(HS))的血清样本。

所有NMO患者都符合Wingerchuk 2006年的标准。所有LETM患者均被临床确诊为至少三节的脊髓病变。多发性硬化症的诊断依据McDonald标准。

同样的血清样本曾使用间接免疫荧光法(IIF)产品(“Neurology Mosaic 17", Euroimmun, Luebeck, Germany)检测NMO-IgG。




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表1  患者和对照组的人口统计学、临床和血清学特征


2.2 方法




AQP4抗体检测采用RSR AQP4Ab ELISA 新产品, 包被的人重组AQP4 M23异构体(RSR Ltd),在全自动ELISA操作系统(SkyLAB 752 DASITGroup, Cornaredo, Italy)完成。




2.3分析评估

· 精密度研究



使用RSR ELISA产品中两种商用阳性对照血清(AQP4 Ab C-1,12.1 U/mL和C-2,28 U /mL),在不同日内进行了5次独立的试验,每次均进行3次重复的检测,以验证批内、不同日间和实验室内精准度。符合临床和实验室标准协会(CLSI)的EP15-A3指南。




· 统计分析



使用ANOVA方差分析评估批内、不同日间和实验室内精密度。

使用受试者工作特征曲线(ROC曲线)确定AQP4抗体检测合适的临界值。

使用NMOSD组患者的AQP4抗体检测结果进行灵敏度分析,用对照组检测结果进行特异性分析。采用似然比 (LR)评价ELISA的临床应用价值。根据常规,LR (阳性似然比)阳性>10或LR (阴性似然比)阴性< 0.1的检测被认为是临床有用的。Kruskal-Wallis检验用于评估患者组和对照组之间的AQPR抗体水平差异,Mann-Whitney unpaired U检验用于比较不同组的抗体中位数水平。用Fisher’s exact检验评估NMO和LETM患者AQP4抗体占比的差异。P值<0.05认为统计学有显著差异。

使用MedCalc软件(Marialerke, Belgium)进行ROC曲线分析,使用GraphPad Prism Version 5和Analyse-it Version 4.10.2.进行所有的统计分析。




3. 结果


3.1精密度测试



C-1的平均浓度为12.41 U/mL,批内CV%为3.2%,不同日间CV%为7.6%,实验室内CV%为8.2%。C-2平均浓度为28.12 U/mL,批内CV%为3.0%,不同日间CV%为7.4%,实验室内CV%为8.0%。总重复性,以标准差(SD)表示(实验室内),C-1结果为1.02,C-2结果为2.25,分别接近制造商所声明的基于重复性获得的验证值1.96和4.20(SD C-1=1.30 和SD C-2=2.77),精密度测试的数据见表2。




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表2 根据CLSI EP15-A评价AQP4抗体ELISA检测的精密度


3.2 AQP4抗体检测



ELISA可实现对AQP4抗体水平的定量检测。在NMOSD患者中,抗体浓度范围在1.5 U/mL和464 U/mL间。抗体浓度中位数为NMO患者27.9 U/mL (1.5-464 U/mL),LETM患者1.5 U/mL (1.5-214.5 U/mL),ON和脊髓炎患者分别为1.5 U/mL (1.5-1.9 U/mL) 和1.5 U/mL (1.5-3.1 U/mL)。对照组的平均浓度为1.5 U/mL (1.5-2.1 U/mL)。

NMO组血清中抗AQP4抗体浓度中位数高于其他NMOSD组和对照组(Kruskal-Wallis检验,p < 0.0001)。尤其是,NMO患者抗AQP4抗体浓度中位数高于LETM和ON患者(图1)。




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图1 NMO患者,LETM患者,ON患者,脱髓鞘患者及对照组(包括:多发性硬化(MS)和健康研究对象(HS))中AQP4自身抗体水平的分布,以Unit/mL表示。Kruskal Wallis test, p < 0.0001; NMO患者的AQP4抗体水平中位数在统计学意义上高于LETM和ON患者的抗体水平 (Mann–Whitney Unpaired U-test, p = 0.0006 and p < 0.0001, respectively)




由ROC曲线确定临界值为2.1U/mL,ELISA检测AQP4抗体在NMO患者的灵敏度为83.3% (95% CI 62.6% ~ 95.2%),特异性为100% (95% CI 87.1%-100%),以及非常高的阳性似然比(∞) 和阴性似然比(0.17)(表 3)。NMO患者的计算出的曲线下面积(AUC)的值为0.895 (95% CI 0.777-0.963) (图2)。


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图2  a NMO患者AQP4自身抗体的(ROC)曲线分析。曲线下面积(AUC)是0.895。B LETM患者AQP4自身抗体检测的ROC曲线分析。AUC是0.625。连续线为ELISA法;虚线表示95%的置信区间


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表3 NMO和LETM患者的诊断灵敏度、特异性和似然比(阳性似然比、阴性似然比)


在相同的临界值下,LETM患者的灵敏度和特异性分别为25% (95% CI 9.8%-46.7%)和100% (95% CI 87.1%-100%),阳性似然比是∞,阴性似然比是0.75(表3)。


NMO患者与LETM患者AQP4抗体比例的差异有统计学意义(分别为83.3%和25%)( Fisher exact检验,p = 0.0001)。


13例ON患者组均为AQP4抗体阴性,3例脊髓炎患者组除1例外其他2例为AQP4抗体阴性。所有对照均为AQP4抗体阴性。


间接免疫荧光法(IIF)与ELISA方法的结果完全一致 (Cohen’s Kappa = 1.00)。


4. 讨论


AQP4抗体是辅助诊断NMO患者的一个重要的工具,并已被纳入该疾病的修订诊断标准。最近,AQP4抗体也在单一横贯脊髓炎患者、单一视神经炎患者以及患有NMOSD并同时存在结缔组织疾病的患者中被发现。因此,国际NMO诊断小组(IPND) 根据患者血清中AQP4抗体的存在,引入了新的命名法和新的诊断标准。新命名将所有与NMO相关的疾病统一为NMOSD,进一步分为AQP4抗体阳性的NMOSD、AQP4抗体阴性的NMOSD和AQP4抗体状态不明的NMOSD。这些新标准使需要检测水通道蛋白4抗体的临床病例数量增加。


检测AQP4抗体的重要性不仅因为NMO与MS尽早和准确的鉴别诊断,并且还因为两者治疗策略的差异。诸如β-干扰素和醋酸格拉替雷(Copaxone)的免疫调节药物被认为是多发性硬化症的第一选择,免疫抑制药物特别是B细胞靶向治疗被认为是治疗NMO的有利因素。 


多种AQP4抗体的检测方法已经被研发。其中基于AQP4-M1异构体的血清学检测是首先被使用的方法。直到近些年,随着OAPs被证明为是NMO-IgG主要的靶点,AQP4-M23才被越来越广泛地用作靶点抗原。


Kim等使用内部ELISA,同时检测了两种异构体,在确诊或高危NMO患者的检出率方面,没有发现异构体之间的任何差异,他们选择使用M23异构体,因为它提高了信噪比。同样的,Waters等通过商用CBA,在比较人类M1或M23异构体时,没有发现灵敏度的差异,但使用M23的信号增加。Mader使用活的人胚胎肾(HEK)细胞,发现M23异构体的灵敏度更高。这些作者还观察到两种方法中不同的染色模式。与M23异构体相比,与M1异构体结合的抗体显示出更小的染色斑点,这支持了之前的数据,M23异构体在HEK细胞中形成OAP。


此外,使用NMO患者的血清和重组AQP4特异性单克隆抗体,Crane等发现,由于OAP结构的原因,M23比M1在AQP4-IgG单克隆抗体或其Fab片段上显示出具有持续的更高的亲和力,这再次表明AQP4异构体的选择以及OAP的结构可以直接影响检测灵敏度。


本研究的目的是评价一种新的商用M23抗原ELISA检测AQP4抗体的性能。结果与间接免疫荧光法商用IIF产品的结果进行比较。虽然没有直接与使用M1-AQP4的ELISA进行比较,但我们的数据显示,灵敏度(83.3%) 高于之前使用M1异构体的研究报告,与CBA获得的平均灵敏度相似(76.7%;范围55.6-96.7%),显著高于其他方法(范围48.5-62.3%)。


最后,ELISA检测结果与目前检测AQP4抗体的参考方法(间接免疫荧光法IIF)检测结果一致(100%一致)。


我们的研究也旨在评价这种新的AQP4 抗体ELISA分析方法的准确性。它的重要性在于,因为一些方法在不同的实验室应用时产生了不一致的结果,同一样品在不同的检测方法中检测出不一致的结果。然而,结果可重复的AQP4抗体检测对于大型多中心研究来说至关重要,这些研究旨在更好地确定NMO患者的流行病学、临床和病理特征以及他们对治疗的反应。


我们发现,使用两种不同抗体浓度检测批内、不同日间和实验室内以CV表示的精密度变异系数低,在对低浓度和高浓度AQP4抗体的阳性对照上测量的总重复性甚至比相同浓度水平下制造商所声称的更好。


该检测具有良好的分析精密度和准确度,以及在全自动系统上体现的相对易用和快速响应的的特性,证明该检测对于适用于日常检测,并可能适合用于AQP4抗体的长期监测。


本研究的进步意义体现在两个重要方面。一方面是可以使各家实验室获得简单易用的AQP4抗体定量方法,另一方面是这款新的ELISA方法在特异性与灵敏度上的良好表现,其性能与当下的金标准CBA方法一致。


本研究初次评价了一种新型的商用ELISA检测AQP4抗体的方法,是一种有效的CBA替代方法。我们相信,我们的发现可以为辅助AQP4抗体检测奠定基础,从而促进对NMOSD病人更早、更准确的诊断。




参考文献:Tampoia M ,  Abbracciavento L ,  Barberio G , et al. A new M23-based ELISA assay for anti-aquaporin 4 autoantibodies: diagnostic accuracy and clinical correlation[J]. Auto-Immunity Highlights, 2019, 10(1).



 原文标题:

A new M23-based ELISA assay for anti-aquaporin 4 autoantibodies: diagnostic accuracy and clinical correlation


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