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HNF1A基因内含子突变导致异常剪接并削弱其作为转录因子的活性
发布时间:2022-03-14   点击次数:719次


2022年中国糖尿病分型诊断专家共识指出,临床诊疗中如怀疑为单基因糖尿病,需先排除患者存在胰岛自身免疫后再行基因筛查。在2022年的最新国内研究中,研究者使用英国RSR公司GADAb、IA-2Ab、ZnT8Ab ELISA 试剂盒进行抗体筛查,确认研究对象抗体均为阴性,方开展后续相关的基因检测研究,从而实现糖尿病的准确分型。


背景:


青年发病成年型糖尿病(MODY)是一种常染色体显性遗传的糖尿病类型,其发病年龄通常在25岁之前。MODY3是亚洲人群中最常见的MODY亚型,由肝细胞核因子1A(HNF1A)杂合突变引起。进行性β细胞功能障碍伴胰岛素分泌不足是MODY3的主要临床特征。MODY3患者通常表现为由于肾脏葡萄糖重吸收减少所致的糖尿。由于不同家庭的临床表现不同,大多数MODY3患者经常被误认为1型糖尿病或早发性2型糖尿病对于这些患者,可以给予胰岛素或二甲双胍来维持正常血糖。目前有研究证明磺脲类药物对MODY3患者的降糖效果优于二甲双胍。因此,对MODY3进行准确的诊断和治疗是非常重要的。越来越多的基因分析为区分单基因糖尿病(包括MODY3)和1型或2型糖尿病提供了机会。


HNF1A是一种转录因子,已被证实在胰腺、肝、肾、胃和肠中高表达。它负责调节许多肝脏特异性基因,以及涉及葡萄糖代谢的关键基因。到目前为止,HGMD数据库提供了500多个HNF1A突变,从启动子到3’UTR区域,多达250个突变可以导致MODY3。然而位于内含子等非编码区的突变却鲜有报道和研究。内含子-外显子连接处的一些突变可能会破坏原有的剪接位点,而位于内含子剪接增强子的其他突变可能会影响剪接效率。这些剪接突变占致病突变的15%-30%。尽管如此,关于剪接突变功能评估的研究尚不充分。


研究目的:


在这项研究中,我们在一位30岁无肥胖的女性早发性糖尿病患者中发现了HNF1A内含子7内含子剪接位点上游的第6个核苷酸突变,命名为IVS7-6G>A。该突变以前在MODY患者中被发现,并在转化的淋巴母细胞中被证明这种突变会导致外显子7的跳过。然而,该突变的功能后果仍有待进一步研究。在此,我们用体外“微基因"实验证实IVS7-6G>A突变确实影响HNF1A mRNA的剪接。重要的是,我们发现错误剪接干扰了HNF1A的亚细胞定位和反式激活。HNF1A的TAD在核化中也起作用,其中残基282-501比残基502-631更重要。我们的观察重在理解内含子突变引起的疾病,并增加对MODY3致病机制的理解。


材料与方法(略)


结果:


1. MODY3家族的临床特征和突变筛查


在MODY3家族中,先证者和她的母亲分别在15岁和30岁时被诊断出患有糖尿病,她的姨妈的葡萄糖耐量受损。表1总结了先证者及其母亲的详细临床特征。在先证者和她的母亲中,口服葡萄糖耐量试验(OGTT)2小时后血糖水平显着升高,胰岛素分泌受损。在该研究中,患者母女已使用英国RSR公司 GADAb、IA-2Ab、 ZnT8Ab ELISA试剂盒进行抗体筛查,确认抗体均为阴性,排除了自身免疫因素后再按计划接受测序。先证者接受小剂量的格列喹酮(45 mg/天)治疗,血糖控制良好(空腹血糖为5-6 mmol/L,餐后2小时血糖为5-9 mmol/L)。由于正处于哺乳期,她目前正在接受胰岛素治疗,并且糖尿病得到了很好的控制(HbA1C 6.3%)。然而,格列美脲(6 mg/天)不能很好地控制先证者母亲的糖尿病,并且在40岁时开始遭受糖尿病并发症,包括糖尿病肾病,糖尿病性周围血管病变,糖尿病性神jing病和糖尿病视网膜病变。出现症状时即接受胰岛素治疗。在先证者中检测到杂合的HNF1A内含子突变IVS7-6G>A,谱系表明先证者的突变是从她的母亲那里遗传的。


2. HNF1A IVS7-6G A基因突变导致mRNA剪接异常和mRNA不稳定


在微基因检测中,首先构建了野生型或IVS7-6G>A突变型HNF1A微基因载体。然后将它们各自转染到HEK293T细胞中并分析RT-PCR产物。同时,设计的正向和反向引物只能扩增HNF1A微基因载体的产物,以避免内源性HNF1A剪接的干扰。为了确认HNF1A IVS7-6G>细胞中是否翻译了异常蛋白,将蛋白表达质粒用于进行蛋白质印迹(WB)实验。结果显示HNF1A IVS7-6G A基因突变导致mRNA剪接异常和mRNA不稳定。


3. HNF1A IVS7-6G A蛋白(L502S fs*和G437A fs*)的降解速率与野生型相似


通常,具有提前终止密码子的蛋白质将通过不同的机制降解(Karamyshev和Karamysheva,2018)。这两个剪接变体是否遭受更高的蛋白质降解?在此,使用环己酰亚胺(减弱的新蛋白质合成)和MG132(蛋白酶体抑制剂),并通过WB分析野生型和突变型HNF1A的半衰期。结果显示HNF1A IVS7-6G A蛋白(L502S fs*和G437A fs*)的降解速率与野生型相似。


4. HNF1A IVS7-6G > A突变降低MIN6细胞的转录活性


首先,在四个报告基因实验中,L502S fs*、G437A fs* 和 A501* 的转录活性约为野生型的 30-50%,TADm 约为野生型的 20-30%(图 4C-F)。其次,L502S fs* 和 A501* 在四个报告基因实验中没有显着差异,这可能表明 L502S fs* 的 47 个异常 C 端氨基酸没有造成负面影响(图 4C-F,第二和第四小节)。第三,与 A501* 相比,TADm 在 GLUT2、CRP 和白蛋白中的转录活性降低了 50% 以上,这可能表明 TAD 的残基 282-501 比残基 502-631 更有效(图 4C、E、F ,第四和第五小节)。根据我们的结果,我们不知道不同的部位是否与不同的靶基因有选择性的相互作用。由于 HNF1A 具有 N 端二聚结构域并且通常与同型二聚体结合,因此涉及显性负效应。结果显示,与L502S fs*或G437A fs*共表达的野生型值比野生型低30%~40%,差异显着(图4C和D,最后2条)。


图片

图4 MIN6细胞中靶基因启动子的野生型和突变型HNF1A转录活性分析。


5. HNF1A IVS7-6G > A 突变损害了 MIN6 细胞的细胞内定位,在高糖条件下可能会加重


完整的成核对于转录因子HNF1A的功能很重要。我们评估了野生型和不同突变体在转染的MIN6细胞中的亚细胞定位。在正常培养条件下(25.5 mmol/L葡萄糖),几乎所有野生型HNF1A仅限于细胞核。令人惊讶的是,约30%的L502S fs*,28%的A501*,39%的G437A fs*和49%的TADm位于细胞核和细胞质中。由于胰岛β细胞对葡萄糖浓度的变化非常敏感,我们在2.8 mmol/L葡萄糖预处理6 h后,在2.8 mmol/L和16.7 mmol/L葡萄糖条件下进行相同的实验,验证葡萄糖浓度变化是否会影响野生型和突变型HNF1A的成核。结果显示HNF1A IVS7-6G > A 突变损害了 MIN6 细胞的细胞内定位,在高糖条件下可能会加重。


总结:

我们发现与MODY3相关的HNF1A IVS7-6G>A突变引起异常的mRNA剪接,形成具有截短的TAD的异常蛋白。HNF1A的TAD不仅对其调节活性很重要,而且对其成核也很重要。对于HNF1A的功能,TAD处的残基282–501比502–631更重要。本研究揭示了HNF1A中内含子突变对基因活性和表达的影响同样会引起胰岛β细胞功能异常,为增加MODY3致病机制的理解提供更多依据。


参考文献:Wang M, Shu H, Xie J, Huang Y, Wang K, Feng R, Yu X, Guan J, Feng W, Liu M. An intron mutation of HNF1A causes abnormal splicing and impairs its activity as a transcription factor. Mol Cell Endocrinol. 2022 Apr 5;545:111575.


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